Hartfalen is een volksgezondheidsprobleem dat een aanzienlijke invloed heeft op de dagelijkse bedrijfsvoering en de kwaliteit van leven van veel getroffen personen2. Grote depressie bij chronisch hartfalen en de toenemende rol daarvan in de sterfte door hartfalen is een bijkomend probleem3. Hoewel paddo’s in de oudheid en recent zijn gebruikt voor genezing van de geest en bekend staan om het verbeteren van de kwaliteit van leven, is hun veiligheid bij cardiovasculaire aandoeningen zoals hartfalen niet bekend. Onze studie onderzocht voor het eerst de effecten van de warm- en koud-water extracten van Panaeolus cyanescens en Psilocybe cubensis paddo’s op ET-1, een belangrijke fysiologische inducer van hypertrofische veranderingen in vitro op rat H9C2 cardiomyocyten, waarbij we de veiligheid of het vermogen van de extracten om deze effecten te verergeren evalueren. Het in vitro H9C2 cardiomyoblast cellen protocol model dat gebruikt werd in de studie werd gekozen op basis van hun bewezen vermogen om fysiologische reacties te vertonen die nuttig zijn bij het ontdekken van geneesmiddelen voor cardiovasculaire geneeskunde17. De resultaten van de studie toonden aan dat behandeling met ET-1 de celafmetingen en de BNP-niveaus van de gestimuleerde cellen aanzienlijk deed toenemen en de mitochondriale activiteit aanzienlijk verminderde, zoals aangegeven door de levensvatbaarheid van de cellen, in vergelijking met de niet-geïnduceerde NO-ET1-cellen. Deze effecten kwamen overeen met eerdere studies die wezen op succesvolle cellulaire ET-1-geïnduceerde hypertrofie in onze studie18.
De waterextracten van P. cubensis en Pan cyanescens paddenstoelen verminderden aanzienlijk de ET-1-geïnduceerde celgrootte metingen van behandelde cellen hetzelfde als de positieve controle, ambrisentan, die selectief de ETA-receptor blokkeert en de ET-1 pro-hypertrofische eigenschappen remt. De vier water extracten verminderden ook significant de ET-1-geïnduceerde concentraties van BNP, een van de bekende hall mark peptiden van hartfalen. Als gevolg hiervan zorgden de vier extracten voor een significante omkering van de twee belangrijkste indices van hypertrofie (celgrootte en BNP-niveaus) geïnduceerd door ET-1 in de gebruikte concentraties. Bovendien verbeterden de vier waterextracten van de twee paddestoelen ook de mitochondriale activiteit van de cellen, wat zich uitte in een toename van de % levensvatbaarheid van cellen die door ET-1 waren geïnduceerd, op een dosis-afhankelijke manier die gelijk was aan die van de positieve controle, ambrisentan, wat wijst op veiligheid bij de concentraties die in de studie werden onderzocht. Verder verlaagden de twee extracten van P. cubensis en het heetwaterextract van Pan cyanescens paddenstoelen de TNF-α concentratie in de behandelde cellen in vergelijking met ET-1-geïnduceerde controlecellen, terwijl het koudwater van Pan cyanescens de concentratie niet-significant verhoogde. TNF-α is een belangrijk pro-inflammatoir cytokine waarvan bekend is dat het hartfunctiestoornissen bevordert en bijdraagt aan hartfalen19. Door TNF-α te verminderen, toonden de drie extracten aan dat ze mogelijk veilig zijn bij hartfalen.
Vele studies hebben vastgesteld dat ROS een zeer belangrijke rol spelen bij de progressie van hart- en vaatziekten zoals hartfalen door oxidatieve stress te induceren, die op zijn beurt leidt tot cel- en weefselschade20. Superoxide- en hydroxylradicalen behoren tot de meest prominente ROS die toxische schade toebrengen aan het menselijk lichaam21. In onze studie hebben wij ROS niveaus gemeten, met name superoxide en hydroxylradicalen, gedurende 1 uur behandeling na 2 uur ET-1 stimulatie. De resultaten toonden aan dat de vier extracten van waterpaddenstoelen de ET-1-geïnduceerde ROS niveaus aanzienlijk terugbrachten, gelijk aan de positieve controle, in vergelijking met ET-1-geïnduceerde controlecellen. Door de ROS-niveaus te verlagen, toonden de extracten een veilig en beschermend effect tegen ET-1-geïnduceerde oxidatieve stress, wat gunstig zal zijn bij hartfalen.
Daarnaast was de afname in ROS waargenomen met de extracten niet te wijten aan toxiciteit, gebaseerd op de positieve toename in celgroeisnelheid (Fig. 4), waar het % levensvatbaarheid van cellen bleef toenemen na 1 uur behandeling. Het was echter ook heel interessant om de verschillen waar te nemen tussen de waterextracten van de twee paddestoelen op de analyse van de celgroeisnelheid in vergelijking met de NO-ET-1-cellen. De cellen die na 1 uur werden behandeld met P. cubensis-extract bleven groeien met een snelheid die dicht bij die van de positieve controle, de ambrisentan- en de NO-ET-1-cellen lag, terwijl het waterextract van Pan cyanescens leidde tot een afname van de celgroeisnelheid die zelfs nog langzamer was dan die welke werd waargenomen bij de met ET-1 geïnduceerde controlecellen. Dit effect toonde aan dat, hoewel de Pan cyanescens waterextracten de ROS niveaus verminderden, zij ook andere verbindingen bevatten die de celgroeisnelheid verlaagden. Het is echter bekend dat Pan cyanescens paddestoelen uniek zijn in die zin dat ze zeer hoge gehaltes aan ureum bevatten naast psilocybine, psilocine, baeocystine, en andere verbindingen waarvan algemeen bekend is dat ze aanwezig zijn in paddo’s22. Van ureum is ook bekend dat het celcyclusvertraging induceert en een langzame toename van cellen in de logfase van de groei bevordert23. Dit zou de reden kunnen zijn voor de afname van de celgroei die werd waargenomen bij de behandeling met Pan cyanescens waterextracten in vergelijking met de andere monsters. We hebben echter ook een verbetering waargenomen vanaf 12 uur in de groeisnelheid van de twee waterextracten van Pan cyanescence, zodanig dat het koude water de hoogste groeisnelheid vertoonde tegen het 48ste uur van de behandeling. Voorzichtigheid is echter geboden met hogere concentraties van Pan cyanescens paddenstoelwater extracten, omdat ze mogelijk celcyclusvertraging kunnen induceren in het eerste uur na consumptie.
Om de veiligheid van de extracten op celschade verder te onderzoeken, toonden de resultaten aan dat de cardiomyocyten geïnduceerd met TNF-α een significante celdood stimuleerden, aangegeven door vermindering van de levensvatbaarheid van geïnduceerde cellen tot onder 80% in vergelijking met normale niet-geïnduceerde cellen. De vier extracten van de twee paddestoelen keerden de door TNF-α geïnduceerde celschade en celdood om, wat blijkt uit een toename van de % levensvatbaarheid van de behandelde cellen in vergelijking met de positieve controle quercetine, en dit op een dosisafhankelijke manier. Dit effect toonde het beschermende effect van de paddenstoel extracten tegen cardiomyocyte schade aan die gunstig zal zijn in een pathologische hypertrofie conditie.
Daarnaast was het ook interessant om te observeren dat, hoewel het koud-water extract van Pan cyanescens paddenstoel de productie van TNF-α concentratie in de ET-1 gestimuleerde cellen na 48 uur niet remde, het extract toch beschermde tegen ET-1 geïnduceerde celdood door de % levensvatbaarheid van de cellen te verhogen, zelfs hoger dan de positieve controle en niet-geïnduceerde cellen bij de concentraties die gebruikt werden in de studie, zoals te zien is in Fig. 3. Dit effect, in combinatie met het beschermende effect van het koudwaterextract op TNF-α-geïnduceerde celschade hierboven, toont aan dat het extract verbindingen kan bevatten die de geïnduceerde-cardiomyocyten-apoptosecascades blokkeren, waarschijnlijk door activering of bevordering van expressies van de celdood-onderdrukkers. Studies hebben aangetoond dat de apoptose-effecten van TNF-α in het hart afhankelijk zijn van het type van zijn receptor, waarbij het zijn cardiotoxische effect via zijn receptor TNFR1 (tumor necrose factor receptor1) vertoont 24,25. Na binding aan zijn TNFR1-receptor kan TNF-α apoptose in cardiomyocyten stimuleren door activering van de sfingomyeline-signaaltransductieroute die leidt tot de productie van de intracellulaire signaalmolecule sfingosine25.
Sfingosine is een bekende effectieve inducer van apoptose in cardiomyocyten en het induceert zijn effect door de expressie van celdoodrepressoren, Bcl-2 (B Cell Lymphoma-2) familie-eiwit, op dezelfde manier te down-reguleren als in andere celtypen25. Bovendien is sfingosine ook een krachtige remmer van proteïnekinase C (PKC), waarvan is aangetoond dat het cellen tegen apoptose beschermt; bijgevolg kan sfingosine apoptose bevorderen door remming van PKC door het niveau van fosforylering van Blc-2 te veranderen25. Bovendien hebben vele studies ook aangetoond dat de bèta-adrenerge receptor1-blokker (β1-blokker) de weerstand van cardiomyocyten tegen celdood verhoogt door het overlevingsbereik van de schakelrespons van Bcl-2 uit te breiden26. Bèta-adrenerge receptor1 is een van de β-adrenerge receptoren waarvan bekend is dat hij het celdoodsignaal overdraagt via cyclische 3′,5′-adenosinemonofosfaat (cAMP)-afhankelijke signaalwegen van cardiomyocyten, wat kan leiden tot de vermindering van de cardiale contractiliteit die verband houdt met de pathofysiologie van hartfalen26. Wij stellen voor dat de waterextracten van Pan cyanescens en P. cubensis paddenstoelen verbindingen bezitten die mogelijk in staat zijn om overexpressie en/of fosforylering van Blc-2 proteïne paden te bevorderen of te activeren, waardoor de geïnduceerde-apoptose wordt geremd en de integriteit van de mitochondriale membraan van de behandelde cellen behouden blijft. En deze verbinding is mogelijk meer uitgesproken in de koud-water extractie van Pan cyanescens paddenstoel.
Daarnaast zijn de onderdrukkende effecten van het twee-water extract van P. cubensis en het warmwaterextract van Pan cyanescens op ET-geïnduceerde TNF-α niveaus van behandelde cellen ook aangegeven dat deze extracten ook activiteit kunnen hebben op de nucleaire factor (NF)-κB signalering, een transcriptiefactor die de expressie reguleert van vele pro-inflammatoire cytokines waaronder TNF-α en de genen geassocieerd met apoptose27. In studies is voorgesteld dat de ontstekingsgerelateerde NF-κB-signalering en de correlatie daarvan met apoptose het onderliggende mechanisme is bij de pathogenese van hartfalen28. Bovendien kan oxidatieve stress ook NF-κB activeren en de transcriptie van talrijke pro-apoptotische genen, waaronder Bax, Fas en Fas-ligand, in gang zetten, waardoor apoptose van de hartspiercellen wordt geïnduceerd en hartfalen verder wordt bevorderd29. Een verder onderzoek naar de werkingsmechanismen in vitro en in vivo wordt daarom aanbevolen. Bovendien werd in eerdere studies vastgesteld dat zowel Pan cyanescens als P. cubensis paddenstoelen mycochemische verbindingen bevatten, zoals alkaloïden, met bekende biologische activiteiten, waaronder toxiciteit tegen cellen van vreemde organismen22,30. Saponinen, die bekend staan als krachtige antioxidanten die vrije radicalen neutraliseren, en flavonoïden met antioxidante, ontstekingsremmende en anti-carcinogene activiteiten22,30. Tenslotte werden in de twee paddestoelen ook tannines met antioxiderende eigenschappen ontdekt, waarvan bekend is dat ze gebruikt worden tegen hartziekten22,30. De aanwezigheid van deze verbindingen zou ook een rol kunnen hebben gespeeld bij de beschermende activiteiten die de waterextracten van Pan cyanescens en P. cubensis paddenstoelen in de studie vertoonden. De studie toonde ook aan dat in het algemeen de cardioprotectieve effecten meer uitgesproken waren bij de heetwaterextracten van de twee paddenstoelen in vergelijking met de koudwaterextracties, wat suggereert dat gebruikers van de paddenstoelen die de paddenstoelen met thee consumeren er meer baat bij hebben.
Concluderend toonde de studie aan dat ET-1 de celgrootte metingen, BNP, TNF-α en ROS niveaus significant verhoogde en de mitochondriale activiteit van de gestimuleerde cardiomyocyte cellen verminderde. De resultaten toonden aan dat de waterextracten van P. cubensis en Pan cyanescens paddestoelen de celgrootte en het BNP-niveau, twee indices van hypertrofie, aanzienlijk terugdrongen en de levensvatbaarheid van de cellen verhoogden. De twee waterextracten van P. cubensis en het heetwaterextract van Pan cyanescens paddenstoelen verminderden ook significant de door ET-1 veroorzaakte TNF-α, een pro-inflammatoire cytokine die betrokken is bij de progressie van pathologische hypertrofie en hartfalen. De vier extracten remden ook aanzienlijk de door ET-1 geïnduceerde intracellulaire ROS niveaus, wat wijst op potentiële veiligheid in deze omstandigheden. Bovendien vertoonden de extracten beschermende eigenschappen tegen TNF-α-geïnduceerde celschade en -dood in de concentraties die in de studie werden onderzocht.
Tot slot stelde de studie voor dat de waterextracten van Panaeolus cyanescens en Psilocybe cubensis paddenstoelen de ET-1-geïnduceerde hypertrofische veranderingen niet verhoogden, in plaats daarvan hadden de twee paddenstoelen cardioprotectieve potentiële eigenschappen en verlichtten ze ook tegen TNF-α-geïnduceerde celschade en -dood in de onderzochte concentraties. De studie wees voor het eerst op de veiligheid en de potentiële gunstige eigenschappen van het gebruik van Panaeolus cyanescens en Psilocybe cubensis paddenstoelen bij hartfalen waarbij ET-1 het verloop is van pathologische hypertrofische veranderingen. Voorzichtigheid is echter geboden bij hogere concentraties. Verder onderzoek is nodig om de onderliggende werkingsmechanismen vast te stellen.