Sanes en Lichtman gebruikten pronucleaire injectie om deze Brainbow constructen in muizen in te brengen. Toen ze de hersenen van de muizen in beeld brachten, vonden ze veel meer dan 3-4 kleuren als gevolg van de tandemintegratie van meerdere kopieën van het construct (ongeveer 8 in Brainbow-1.0 muizen.) Het combinatorische effect van meerdere, onafhankelijke recombinatiegebeurtenissen leidt tot een regenboog van kleuren. Met drie kopieën van het construct zou men tien kleuren verwachten (zie tabel rechts); in verschillende rapporten hebben Sanes en Lichtman 90-160 verschillende kleuren waargenomen als gevolg van een hoger kopie-aantal. De naam Brainbow is werkelijk passend voor deze kleurrijke technologie.
Optimalisering van het systeem: Brainbow-3
Hoewel Brainbow neurowetenschappers voorzag van het enorme kleurengamma dat nodig was om individuele neuronen te markeren, leed het systeem ook onder een aantal beperkingen. Ten eerste, de beeldvorming van Brainbow muis weefsel was uitdagend als gevolg van lage fluorescentie-intensiteit, deels veroorzaakt door fluorofoor fotoinstabiliteit, evenals de neiging van fluoroforen te aggregeren in de neuronen ‘somata. Ten tweede liet het systeem geen analyse door immunokleuring toe. Hoewel de gebruikte fluoroforen fluorescent verschillend zijn, zijn hun eiwitsequenties zeer homoloog, wat het ontwerp van antilichamen specifiek voor elke fluorofoor verhindert. Ten derde bevatten Brainbow-1 en Brainbow-2 elk een “standaard” toestand; bijvoorbeeld, Brainbow-1.0 drukt RFP uit wanneer het construct geen recombinatie heeft ondergaan. Deze standaardtoestand werd onevenredig uitgedrukt door een meerderheid van neuronen, waardoor het aantal verschillende kleuren dat in een bepaald gebied kon worden waargenomen, werd beperkt.
In 2013 brachten Dawen Cai, et al. een verfijning van de Brainbow-technologie uit, Brainbow-3.0, met het doel om de hierboven genoemde beperkingen te overwinnen. Eerst screenden ze een verscheidenheid aan fluorescerende eiwitten om die met ideale kenmerken (lage aggregatie, hoge fotostabiliteit en hoge stabiliteit na fixatie) te vinden. Uit de zeven resulterende eiwitten kozen ze er drie met lage niveaus van zowel fluorescentie als sequentieoverlap (koraal mOrange2, kwal EGFP, en zeeanemoon mKate2.) Vervolgens genereerden ze met succes aangepaste antilichamen tegen elk van deze eiwitten en bevestigden ze dat er geen kruisreactiviteit was, wat de deur opende voor immunokleuringanalyse. Om zelfs cellabeling te bereiken, genereerden zij gefarnesyleerde derivaten van de fluorescerende eiwitten, die direct naar celmembranen worden getransporteerd. Membraantransport van gefarnesyleerde derivaten maakt labeling mogelijk van delicate axonale en dendritische processen die voorheen niet zichtbaar waren met Brainbow-1 en -2.
De algemene structuur van Brainbow-1.0 is behouden in Brainbow-3.0, maar met mOrange2, EGFP en mKate2 als de fluoroforen; mOrange2 is de standaardtoestand. Brainbow-3.1 en -3.2 daarentegen vertonen geen standaard fluorescentie als gevolg van de toevoeging van translatie-blokkerende STOP-cassette onmiddellijk na de promotor. De STOP cassette bevat een mutant YFP dat niet fluoresceert, maar kan worden gedetecteerd via immunokleuring. Deze eigenschap vergemakkelijkt het screenen van Cre-negatieve Brainbow muizen om het aantal en type cellen te bepalen waarin het construct tot expressie komt. De fotostabiliteit van Brainbow-3.2 is verbeterd door de toevoeging van een post-transcriptioneel regulerend element van het bosmarmot hepatitisvirus (WPRE), dat vaak wordt gebruikt om de transgene eiwitniveaus te verhogen.
Brainbow-varianten en toepassingen buiten de muizenhersenen
Naast het verbeteren van het Brainbow-systeem, ontwikkelden Sanes en Lichtman ook een complementair Flpbow-construct dat functioneel vergelijkbaar is met Cre-gebaseerde Brainbow, maar wordt gecontroleerd door FLP/FRT-recombinase. Wanneer geplaatst onder verschillende promotors, kunnen Brainbow en Flpbow worden gebruikt om verschillende celpopulaties te labelen.
Om het fokken van dieren te verminderen die nodig zijn om dieren met Brainbow transgenen en Cre te produceren, creëerden Cai et al. ook een Autobow construct dat zowel Cre als XFP’s bevat. Cre productie drijft recombinatie en XFP selectie aan, gevolgd door Cre zelfexcisie. Deze constructen zijn stabiel gehandhaafd door ten minste zes generaties.
Naast de neuronale pThy1-Brainbow constructen, Addgene heeft ook twee Brainbow adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV) beschikbaar – AAV-EF1a-BbChT en AAV-EF1a-BbTagBY. Deze constructen bevatten twee XFP’s elk als gevolg van grootte beperkingen geassocieerd met AAV; co-infectie met beide constructen produceert een minimum van 8 kleuren. Het gebruik van AAV biedt ruimtelijke en temporele controle zonder de noodzaak van kiembaan modificatie, en maakt Brainbow worden gebruikt in een verscheidenheid van soorten.
Meer varianten zijn gemaakt door andere labs, waaronder R26R-Confetti beschreven in Hugo J. Snippert, et al. (2010) en de MAGIC Marker strategie beschreven in Karine Loulier, et al. (2014).
Huidig worden Brainbow technieken ook toegepast op modelorganismen zoals Drosophila en zebravis te bestuderen. Brainbow in Drosophila heeft geholpen bij het in kaart brengen van neurale circuits, zoals verbindingen tussen motorneuronen en de neuromusculaire junctie. In zebravis, is de methode zeer nuttig geworden in lineage tracing; “Zebrabow” werd gebruikt om de ontwikkeling van het hoornvliesepitheel te traceren.
Voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in neurowetenschappen en ontwikkeling, is Brainbow een waardevol instrument om enkele cellen te markeren en te volgen vanwege het brede scala en de hoge stabiliteit van kleuren. Sanes en Lichtman schatten dat Brainbow’s kleurrijke etikettering de tijd voor het in kaart brengen van een bepaalde sectie van de hersenen met ten minste een orde van grootte heeft verminderd. Het is duidelijk dat verdere verfijningen van de Brainbow techniek belangrijke inzichten zullen verschaffen in de gecompliceerde fysieke organisatie van de hersenen en andere biologische systemen.
Interesseerd in het toepassen van Brainbow op uw onderzoek?
Vind Brainbow plasmiden @Addgene:
- Brainbow 1.0, 1.1, 2.1 plasmiden
- Brainbow 3.0, 3.1, 3.2 plasmiden
Transgene strategieën voor combinatorische expressie van fluorescerende eiwitten in het zenuwstelsel. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
Een technicolor benadering van het connectoom. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: een op recombinase gebaseerde fluorescentielabelingstechniek om neurale expressiepatronen onder te verdelen. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Betere hulpmiddelen voor de Brainbow toolbox. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: multispectrale cellabeling voor celtracering en lineage analyse in zebravis. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
