Functies van Danggui Buxue Tang, een Chinees kruidenaftreksel dat Astragali Radix en Angelicae Sinensis Radix bevat, in baarmoeder en lever zijn zowel oestrogeen receptor-afhankelijk als -onafhankelijk

Abstract

Danggui Buxue Tang (DBT), een kruidenafkooksel dat Astragali Radix (AR) en Angelicae Sinensis Radix (ASR) bevat, wordt in China al meer dan 800 jaar gebruikt voor de behandeling van onregelmatige menopauze bij vrouwen. Farmacologische resultaten toonden aan dat DBT significante oestrogene eigenschappen vertoonde in vitro, wat dus suggereerde dat DBT de nucleaire oestrogeenreceptoren zou kunnen activeren. Hier hebben we de oestrogene eigenschappen van DBT beoordeeld in een in vivo rattenmodel met ovariectomie: DBT werd aangebracht op de geovariectomiseerde ratten gedurende 3 dagen. De toepassing van DBT veranderde het gewicht van de baarmoeder en de lever niet, evenmin als de expressie van de proliferatie markers inclusief de oestrogeen receptoren α en β. DBT stimuleerde echter de expressie van de oestrogeen responsieve genen. Bovendien werd de inductieve rol van DBT op de expressie van leden van de aryl koolwaterstof receptor familie in de baarmoeder en lever van geovariectomiseerde ratten bevestigd. Deze reacties van DBT waren echter duidelijk verschillend van het reactiepatroon dat hier voor 17β-estradiol kon worden vastgesteld. DBT vertoonde dus zwakke, maar significante, oestrogene eigenschappen in vivo; sommige van zijn activiteiten waren echter onafhankelijk van de oestrogeenreceptor. DBT zou dus een opwindend Chinees kruidenaftreksel kunnen zijn voor een alternatieve behandeling van hormoonvervangingstherapie voor vrouwen in de menopauze zonder latere oestrogene bijwerkingen.

1. Inleiding

Traditionele Chinese geneesmiddelen (TCM’s) worden in China al meer dan duizend jaar gebruikt als geneesmiddel of als voedingssupplement voor de gezondheid. Historisch gezien worden TCM’s bereid als afkooksels door een unieke methodologie met specifieke combinaties van verschillende kruiden als formule. Onder de duizenden kruidenformules is Danggui Buxue Tang (DBT) een eenvoudig kruidenafkooksel dat is samengesteld uit twee kruiden. DBT werd voor het eerst beschreven in Neiwaishang Bianhuo Lun door Li Dongyuan in China in AD 1247. Li beschreef dat de DBT-formule 10 qian van Astragali Radix (AR), wortels van Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungevar. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao, en twee qian van Angelicae Sinensis Radix (ASR), wortels van Angelica sinensis (Oliv.) Diels, moest bevatten. Eén qian komt overeen met ongeveer 3 gram. DBT wordt in China aan vrouwen voorgeschreven als remedie tegen menopauzesymptomen, die hun gezondheid verbetert door de “Qi” (vitale energie) te verhogen en het “bloed” (de bloedsomloop) te voeden.

Vrouwen in de menopauze hebben last van opvliegers, zweten, angst en stemmingswisselingen, maar ook van een verhoogd risico op veel gezondheidsproblemen, zoals verlies van botdichtheid (osteoporose) en hart- en vaatziekten. Deze problemen zijn grotendeels te wijten aan het tekort aan eierstokhormonen, vooral oestrogenen . Hormoonvervangingstherapie (HRT) is jarenlang gebruikt om de symptomen van de menopauze te verlichten, maar deze behandeling werd in verband gebracht met bijwerkingen, namelijk een verhoogd risico op borstkanker, hartaanvallen en beroerten. Met het oog op deze klinische risico’s zijn uitgebreide inspanningen gewijd aan het zoeken naar of ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen die de voordelen van hormoontherapie zouden bieden, maar met minimale risico’s . De TCM, die duizenden geneeskrachtige kruiden bevat, is een veelbelovende bron die een perfecte oplossing zou kunnen bieden. Sommige van de kruidenproducten vertoonden inderdaad een uitgesproken werkzaamheid tegen symptomen van de menopauze en werden bijgevolg op grote schaal gebruikt door vrouwen om hun symptomen van de menopauze te verlichten, bijvoorbeeld DBT . In vitro experimenten met cellen uit de borstklier en botten suggereren dat tenminste een deel van de werkzaamheid van DBT gemedieerd wordt door oestrogeen receptor- (ER-) afhankelijke mechanismen. Om deze waarnemingen in vivo te ondersteunen, werd DBT in het ovariectomiseerde Wistar rat model getest op potentiële oestrogene eigenschappen. Aangezien DBT een afkooksel is dat traditioneel als thee wordt geconsumeerd, werden de dieren via het drinkwater van DBT voorzien. Met deze aanpak voerden we een driedaagse uterotrofe test uit om reacties te onthullen die relevant zijn om bij te dragen tot de opheldering van de moleculaire werkingsmechanismen van DBT, met inbegrip van orgaangewichten en regulatie van genexpressie.

2. Materialen en Methoden

2.1.

Drie jaar oude AR afkomstig van de wortels van A. membranaceus var. mongholicus werd verzameld in de provincie Shanxi , en twee jaar oude ASR van A. sinensis was afkomstig van Minxian in de provincie Gansu. Deze plantaardige materialen werden morfologisch geauthenticeerd door Dr. Tina Dong, tijdens de veldcollectie. De corresponderende vouchers als vormen van hele planten, voucher # 02-9-1 voor ASR en voucher # 02-10-4 voor AR, werden gedeponeerd in het Centrum voor Chinese Geneeskunde, The Hong Kong University of Science and Technology. 17β-Estradiol (E2) werd verkregen van Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Duitsland). 250 g gesneden AR en 50 g gesneden ASR werden gemengd (de verhouding is 5 : 1) en vervolgens gekookt in 2400 mL (w : v = 1 : 8) water gedurende 2 uur, en vervolgens werd het afkooksel gefiltreerd. De residuen werden gekookt in 1.800 mL (w : v = 1 : 6) water gedurende 1 uur. De gecombineerde extracten werden gedroogd onder vacuüm en bewaard bij -20°C. Deze extractie, na de oude bereiding, bleek de beste extractieconditie te zijn . Twee chemische markers in AR (calycosine en formononetine) en twee andere in ASR (ferulinezuur en ligustilide) werden gebruikt om de chemische eigenschap van DBT te standaardiseren. De gestandaardiseerde DBT zou niet minder dan 0,186 mg calycosine, 0,155 mg formononetine, 0,351 mg ferulinezuur, en 0,204 mg ligustilide per g gedroogd gewicht DBT moeten bevatten, zoals eerder gerapporteerd

2.2. Dieren

Jonge vrouwelijke Wistar-ratten ( g) werden verkregen van Harlan Winkelmann (Borchen, Duitsland) en werden gehouden onder gecontroleerde omstandigheden van temperatuur (20°C ± 1, relatieve vochtigheid 50-80%) en verlichting (12 uur licht, 12 uur donker). Alle ratten hadden vrije toegang tot standaard rattenvoer (SSniff R10-Diet, SSniff GmbH, Soest, Duitsland) en water. Alle condities voor het houden en behandelen van de dieren waren in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee in Duitsland.

2.3. Uterotrofe test

De oestrogene werking werd getest in de 3-daagse test bij geovariectomiseerde ratten volgens de OECD-richtlijn 440 . De experimentele procedures zijn schematisch samengevat in figuur 1. Kort samengevat werden de dieren, na ovariectomie en 14 dagen endogene hormonale achteruitgang, gedurende 3 dagen behandeld. De dieren werden willekeurig toegewezen aan de behandeling met kruidenextracten, positieve controle, of voertuiggroepen (). DBT werd oraal toegediend in een dosis van 0,01 g/kg BW/d of 1 g/kg BW/d BW en E2 (1 μg/kg BW/d; subcutane injectie), die diende als positieve controle. De dieren werden opgeofferd door decapitatie na lichte anesthesie met CO2-inhalatie. De natte gewichten van baarmoeder en lever werden bepaald. Baarmoeders en levers werden ingevroren in vloeibare stikstof voor de RNA voorbereiding.

Figuur 1

Experimentele opzet. De figuur geeft een samenvatting van de experimentele opzet van de studie. De workflow wordt schematisch weergegeven, evenals de samenvatting van de behandelingsgroepen. bw: lichaamsgewicht; DBT: Danggui Buxue Tang; DBT01 en DBT1: DBT bij 0,01 en 1 g/kg lichaamsgewicht/d.

2.4. Voorbereiding van totaal RNA en omkeringstranscriptie

Het totale cytoplasmatische RNA werd uit de rattenbaarmoeders geëxtraheerd met de standaard TRIzol-methode (Invitrogen, Grand Island, NY). DNA-residuen werden enzymatisch geëlimineerd door digestie (Deoxyribonuclease I, Ambion, Foster City, CA), en de verwijdering werd gecontroleerd door PCR. Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) en Oligo (dT) 12-18 werden gebruikt voor de eerstestrengs cDNA-synthese.

2.5. Kwantitatieve real-time PCR

Quantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen) met behulp van de iCycler thermische cycler met iQ real-time detectiesysteem. De reacties werden driemaal in triplo uitgevoerd. Na vortexen werden aliquots van 50 μl van het mengsel in elk putje van de 96-well dunwandige PCR-plaat (Bio-Rad, Hercules, CA) gepipetteerd. PCR-reacties bestonden uit een eerste denatureringscyclus bij 95°C gedurende 3 min, gevolgd door 50 cycli van 10 s bij 95°C, 15 s bij 60°C, en 30 s bij 72°C. De fluorescentie werd gekwantificeerd aan het eind van de annealingstap bij 60°C en de identiteit van het product werd bevestigd door een smeltcurveanalyse (60-95°C). Primer sequenties en amplicon maten zijn samengevat in de aanvullende tabel 1 in het aanvullend materiaal online beschikbaar op http://dx.doi.org/10.1155/2014/438531. De relatieve mRNA-waarden van de doelgenen werden berekend na normalisatie ten opzichte van een endogeen referentiegen (cytochroom-C-oxidase-subeenheid 1, COX1). De resultaten werden uitgedrukt als relatieve hoeveelheden mRNA ten opzichte van de voertuigcontroledieren met de formule .

2.6. Statistische Analyse

Statistische analyse van de gegevens in dit werk werd uitgevoerd met behulp van twee-weg variantieanalyse, gevolgd door paarsgewijze vergelijking van geselecteerde gemiddelden met behulp van de Student’s -test. Het criterium voor significantie werd gesteld op , , en in vergelijking met de controle.

3. Resultaten

3.1. Lichaamsgewicht en nat gewicht van de organen

De uterotrofe respons bij geovariectomiseerde ratten werd gemeten na 3 dagen behandeling met het geneesmiddel. DBT werd toegepast in twee doses van 0,01 (DBT0,01) en 1 (DBT1) g/kg BW/d. E2 werd gebruikt als positieve controle bij 1 μg/kg BW/d, en de draagstof ricinusolie werd gebruikt als negatieve controle. Deze behandelingen hadden geen effect op het lichaamsgewicht van de dieren (figuur 2(a)). Wat de natte gewichten betreft, veroorzaakte de E2-behandeling gedurende 3 dagen een significante toename van het natte gewicht van de baarmoeder met meer dan het vijfvoudige, maar had geen invloed op het levergewicht (figuur 2(b)). De behandeling met DBT, voor beide concentraties van DBT0.01 en DBT1, had geen effect op het gewicht van baarmoeder en lever (figuur 2 (b)). Deze observatie was in overeenstemming met de expressie van het mRNA van Ki-67, een gevoelige proliferatie marker in de baarmoeder, die echter onveranderd was na de DBT behandeling (figuur 2(c)). De expressie van Ki-67 mRNA is sterk gestimuleerd in reactie op de behandeling met E2 (figuur 2 (c)). In de lever resulteerde geen van de behandelingen in een statistisch significante invloed op de expressie van Ki-67 (figuur 2(c)).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

3.2. 3.2. Oestrogeen-geassocieerde genexpressie in baarmoeder en lever

De mRNA-expressie van ERα en ERβ werd gedetecteerd in de baarmoeder van de rat onder alle behandelingscondities. Na de behandeling met E2 vertoonden de ERα- en ERβ-mRNA’s de verwachte significante downregulatie, vergeleken met de controledieren, terwijl DBT-toepassing de mRNA-expressie van ERα en ERβ niet kon beïnvloeden (figuur 3(a)). Voor ER actie in de baarmoeder, zijn enkele zeer gevoelige marker genen bekend om de oestrogeen reacties te controleren, dat wil zeggen, complement C3 (C3), calcium-bindend eiwit 9 kDa (CaBP9k), en clusterin (Clu). In de baarmoeder resulteerde E2-behandeling in een honderdenvoudige significante upregulatie van het mRNA dat codeert voor C3 en CaBP9k, vergezeld van een significante downregulatie van Clu mRNA-expressie (Figuur 3(b)). Blijkbaar was DBT in staat een zeer milde upregulatie (niet meer dan 5-voudig) van de ER-afhankelijke gereguleerde genen C3 en CaBP9k teweeg te brengen. De hogere dosis DBT veroorzaakte een downregulatie van de Clu-mRNA-expressie, die geen statistisch significante niveaus bereikte vanwege de hoge standaardafwijking van de gemiddelde waarde (figuur 3(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

De mRNA expressie van ERα werd gedetecteerd in de rattenlever onder alle behandelingscondities. De autoregulatoire respons van downregulatie van ERα door E2 bereikte niet het niveau van statistische significantie, terwijl beide DBT-concentraties de steady-state mRNA-niveaus van ERα op een statistisch significante wijze verlaagden (figuur 4(a)). Om de expressie van ERα-afhankelijke responsgenen in de lever te beoordelen, werden de expressieniveaus van geschikte lever-specifieke ER responsgenen, te weten CaBP9k en insuline-achtige groeifactor bindend eiwit I (IGFBP1), bepaald. De E2 behandeling resulteerde in een upregulatie van CaBP9k mRNA expressie en in de downregulatie van 1GFBP1 mRNA expressie in de lever (figuur 4 (b)). De behandeling met een hoge dosis DBT (DBT1) verminderde de expressie van IGFBP1 aanzienlijk. De verhoogde expressie van CaB9k werd geopenbaard na DBT-behandeling bij beide concentraties, maar bereikte in beide gevallen niet het niveau van statistische significantie als gevolg van de variatie (figuur 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

3.3. Lipidenmetabolisme-geassocieerde genexpressie in lever

Omdat DBT verondersteld wordt “Qi” te verhogen, onderzochten wij de expressie van genen geassocieerd met het lipidenmetabolisme. Aangezien de lever de belangrijkste plaats is voor het vetmetabolisme, is de leverfunctie gekoppeld aan zwaarlijvigheid, wat op zijn beurt een risicofactor is voor ziekten in hormoonafhankelijke organen, zoals borstkanker. Daarom onderzochten wij de expressie van Apolipoproteïne A-I (Apo-A1), de belangrijkste component van HDL-cholesterol, en van peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR), die lipidesensors zijn en op verschillende manieren betrokken zijn bij de regulatie van het energiemetabolisme. De opregulatie van PPARα door DBT bereikte niet het niveau van statistische significantie. Wat PPARγ betreft, daalde de expressie van het mRNA van DBT bij een concentratie van 1 g/kg BW/d (figuur 5(a)). Deze downregulatie was vergelijkbaar met die welke door E2 werd geïnduceerd. Integendeel, een effect dat duidelijk onafhankelijk was van de potentiële oestrogene eigenschappen van DBT was de uitgesproken downregulatie van PPARδ mRNA-expressie door beide doses DBT (figuur 5(a)). Deze resultaten wijzen duidelijk op het feit dat DBT de expressie zou kunnen reguleren van receptoren die nauw betrokken zijn bij de regulatie van de beschikbaarheid en het verbruik van energie uit vet door de modulatie van de expressie van de receptoren van de PPAR-familie. Als mogelijk verband met complicaties van het metabool syndroom is de regulering van het cholesterolmetabolisme van belang. Daarom hebben wij de regulatie van de expressie van Apo-A1 mRNA onderzocht. Het uitdrukkingspatroon wijst op een oestrogeenachtige eigenschap van DBT in de concentratie van 1 g/kg BW/d, dat net als E2 de expressie van Apo-A1 mRNA downreguleert.

(a)

(b)

(a)
(b)

3.4. The Regulation of DBT on Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway in Uterus and Liver

Efficient detoxification is also crucial for health. Van de Aryl koolwaterstof receptor (AHR) is bekend dat hij de expressie van metaboliserende/ontgiftende enzymen in de lever en andere weefsels in gang zet, wat op een gecoördineerde manier werkt met de batterij Nrf2-gereguleerde enzymen. Hier onderzochten we de expressie van AhR, AhR familieleden, en AhR responsieve genen in baarmoeder en lever door DBT in vergelijking met E2. Over het algemeen ontdekten we een weefselspecifieke regulatie van de expressie van AhR, AhR-familieleden, en responsgenen na behandeling met DBT.

In de baarmoeder werd de AhR mRNA expressie sterk gedownreguleerd in reactie op E2, terwijl er geen verandering zichtbaar was in reactie op DBT (Figuur 6(a)). De expressie van arylkoolwaterstofreceptor nucleaire translocator 1 (ARNT 1) mRNA, de coregulator van AHR, werd door E2 gedownreguleerd, terwijl DBT bij de hoge dosis leidt tot een upregulatie van ARNT1 mRNA niveaus in dit orgaan. Wat ARNT2 betreft, resulteerde een sterke downregulatie van de mRNA-expressie in de baarmoeder in reactie op de behandeling met E2, een effect dat niet aantoonbaar was in reactie op DBT (Figuur 6(b)). Cytochroom P450 (familie 1) A1 (Cyp1A1) en Glutathione-S-transferases Ya (GST-Ya) worden beschouwd als zeer gevoelige responsgenen voor AhR-functie. Cyp1A1 mRNA niveaus in de baarmoeder werden sterk gedereguleerd door E2, een effect ook detecteerbaar in reactie op beide doses van DBT, maar in een lagere mate (Figuur 6 (c)). GST-Ya mRNA expressie bleek alleen te worden opgehoogd in reactie op E2. DBT-behandeling in beide doses had geen effect op GST-Ya mRNA expressie in de baarmoeder (figuur 6 (c)).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

In de lever was een milde, statistisch niet significante upregulatie van AhR mRNA waarneembaar als reactie op de E2-behandeling, terwijl DBT de AhR mRNA expressie sterk induceerde tot meer dan 3-voudig (figuur 7(a)). Het mRNA-niveau van ARNT1 kon alleen worden geïnduceerd door de lage dosis van DBT, maar niet voor E2, en de hoge dosis van DBT. Bovendien leken alle drie behandelingen de ARNT2-mRNA-expressie te upreguleren; geen van de waarden kon echter het niveau van statistische significantie bereiken (figuur 7(b)). E2 behandeling resulteerde in een milde maar niet significante upregulatie van Cyp1A1 mRNA niveaus, terwijl DBT de Cyp1A1 mRNA expressie op een dosis-afhankelijke manier downreguleert. Daarentegen resulteerde de behandeling met E2 niet in een verandering van de mRNA-expressie van GST-Ya, terwijl DBT in hoge dosis de mRNA-expressie van GST-Ya op een statistisch significante, dosisafhankelijke manier omlaagreguleerde (figuur 7(c)).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

4. Discussie

Hoewel DBT in vitro potentiële oestrogene effecten vertoonde, is de informatie over potentiële hormonale activiteiten van DBT in vivo beperkt. Het is bekend dat de proliferatie van endometriumcellen onder controle staat van oestrogenen en dat het risico van endometriumcarcinoom toeneemt bij oestrogeenvervangingstherapie. Aangezien natuurlijke verbindingen met oestrogeenachtige activiteiten in vivo vaak orgaanselectieve eigenschappen vertonen, hebben wij bovendien het uterotrofe experiment orgaanafhankelijk geëvalueerd. Wij evalueerden de mogelijke effecten van DBT in de baarmoeder, als orgaan van het voortplantingskanaal dat een klassiek doelorgaan van oestrogeenwerking vertegenwoordigt, en in de lever, als de belangrijkste stofwisselingsplaats die een van de organen is waarin ERα overwegend tot expressie komt. Om de invloed van DBT in afwezigheid van endogeen oestrogeen te bestuderen, gebruikten wij geovariectomiseerde vrouwelijke ratten om de ER selectiviteit van DBT in baarmoeder en lever te evalueren.

De resultaten toonden aan dat DBT het natgewicht van baarmoeder en lever of het expressieniveau van proliferatie markers en ERs bij geen van de onderzochte doses veranderde. Voor ER-werking in de baarmoeder zijn enkele zeer gevoelige markergenen bekend die oestrogeenreacties oppikken, namelijk de upregulatie van C3 en CaBP9k en de downregulatie van Clu. C3 en CaBP9k konden door E2 worden geüpreguleerd, terwijl Clu werd gedownreguleerd als reactie op een E2-behandeling in de baarmoeder. DBT bootste in zeer milde mate oestrogene reacties na voor C3 en CaBP9k, maar niet voor Clu. Dit is interessant omdat bij de upregulatie van C3 en CaBP9k ERE-respons elementen betrokken zijn, terwijl het precieze mechanisme van ER-gemedieerde downregulatie van Clu niet bekend is. Gezien de bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren in de promotor van Clu is het echter waarschijnlijk dat SP1- en AP-gemedieerde processen een rol spelen. Tegelijkertijd waren de veranderingen in de expressie van CaBP9k en IGFBP1 in de lever vastgesteld als markers van oestrogeenreactie, hoewel de totale respons veel lager was dan die welke voor CaBP9k of C3 in de baarmoeder kon worden vastgesteld. In de lever oefende DBT opnieuw zwakke oestrogene eigenschappen uit in de 3-daagse uterotrofe test. Effecten waren alleen aantoonbaar met behulp van de meest gevoelige genexpressie-markers van oestrogeenwerking.

De lever is bovendien een belangrijke plaats voor het vetmetabolisme dat in verband wordt gebracht met zwaarlijvigheid en dat op zijn beurt een risicofactor is voor ziekten in hormoonafhankelijke organen zoals borstkanker. Daarom onderzochten wij de expressie van Apo-A1 als de belangrijkste component van HDL-cholesterol en van PPAR-receptoren die op verschillende manieren betrokken zijn bij de regulatie van het energiemetabolisme. Het zijn ook bekende doelwitten voor natuurlijke verbindingen en binding aan deze receptoren verbetert bijvoorbeeld de glucose-opname. Onze resultaten wijzen duidelijk op het feit dat DBT door modulatie van de expressie van de receptoren van de PPAR-familie kan bijdragen tot de regulering van de beschikbaarheid en het gebruik van energie uit vet. Talrijke reviews geven een overzicht van de regulatie van metabolische routes na activering van PPARs , een onderwerp dat buiten de focus van dit artikel valt. Twee kenmerken van onze resultaten met betrekking tot PPAR verdienen echter een bespreking. Een sterke downregulatie van PPARδ in reactie op DBT werd waargenomen. In dit verband is het belangrijk te vermelden dat PPARδ blijkbaar op een oestrogeen/ER-onafhankelijke manier reageerde op DBT-behandeling. De functionele consequenties van de downregulatie van PPARδ expressie door DBT moeten op dit punt open blijven; het is echter niet te wijten aan een autoregulerende downregulatie van PPARδ na binding van bestanddelen van DBT, omdat DBT noch PPARδ noch PPARγ-afhankelijke reportergen activatie in een transiënte transfectie assay stimuleerde (gegevens niet aangetoond). Activering van een PPARδ-afhankelijke signaalcascade door DBT zou echter interessant zijn, omdat PPARδ de belangrijkste regulator is voor mobilisatie van vet en energie-uitgave uit vet en vanwege dit fenotype mogelijk verband houdt met obesitas en de preventie daarvan.

In tegenstelling daarmee reageerde PPARγ, althans bij een hoge dosis DBT, op een oestrogeenachtige manier door te worden gedownreguleerd. Een belangrijk kenmerk naast de insuline-sensibiliserende eigenschappen van PPARγ is dat het de stamcelbestemming van mesenchymale stamcellen bepaalt. De effecten van PPARγ op het skelet zijn intussen goed vastgesteld. Het activeert adipogene differentiatie, en remt daardoor osteogene differentiatie . Deze situatie zou nadelig zijn voor vrouwen in de menopauze en daarom kan downregulatie van PPARγ door DBT wijzen op een gunstig effect.

Het is al lang bekend dat de AhR-route de expressie van metaboliserende enzymen in de lever en in andere weefsels activeert, meestal op een gecoördineerde wijze met de reeks Nrf2 gereguleerde enzymen, en zo bijdraagt tot het ontgiftingsproces. We hebben recent aangetoond dat er een verband bestaat tussen de werking van oestrogeen en de regulatie van AhR en leden van de AhR signaalcascade in de baarmoeder. Daarom hebben we de regulatie van expressie van AhR, AhR familieleden, en AhR responsgenen in baarmoeder en lever door DBT in vergelijking met oestradiol, vergelijkenderwijs onderzocht. Ten eerste bevestigden we het oestrogene reactiepatroon van de AhR-genfamilieleden . Voor de behandeling met DBT ontdekten we een weefselspecifieke regulatie van de expressie van AhR, AhR familieleden, en responsgenen na behandeling met DBT. Cyp1A1 en GST-Ya, naast leden van eerste (Cyp1A1) en tweede pass (GST-Ya) metabole enzymen, worden beschouwd als zeer gevoelige responsgenen met betrekking tot crosstalk mechanismen van het betrekken van AhR en ER pathways en werden hier ook getest. Een interessante observatie is dat DBT-behandeling een oestrogeenachtig reactiepatroon vertoonde voor de regulatie van Cyp1A1 expressie, maar niet voor GST-Ya, wat erop wijst dat de werking van DBT in de lever geassocieerd is met zowel oestrogeenachtige als oestrogeenonafhankelijke eigenschappen. Hetzelfde geldt vermoedelijk voor AhR-geactiveerde reacties. Voor de toekomst zal het interessant zijn om te zien of DBT en/of zijn bestanddelen AhR-gemedieerde reportergen-activiteiten zullen triggeren.

Daarnaast vonden we, zij het in geringe mate, dat ARNT-moleculen door DBT in de lever werden geüpreguleerd. Dit is interessant omdat enkele van de bij dit artikel betrokken auteurs onlangs de upregulatie van HIF1α door DBT beschreven, die uiteindelijk leidt tot upregulatie van erytropoëtine. ARNT1 wordt ook HIF1β genoemd en vertegenwoordigt de heterodimere dimerisatie partner van HIF1α in de bemiddeling van zijn nucleaire reacties . Met andere woorden, we laten hier zien dat DBT niet alleen HIF1α maar ook HIF1β/ARNT1 upreguleert, waardoor het effect van HIF1α op erytropoëse mogelijk wordt ondersteund.

Samenvattend hebben we voor het eerst aangetoond dat DBT de mRNA niveaus van leden van de AhR signaalcascade reguleert, waarbij het zowel oestrogeenachtige als oestrogeenreceptor onafhankelijke activiteiten vertoont, wat vermoedelijk leidt tot een verschillend patroon van ontgiftingsmechanismen. Het laatste belangrijke resultaat was dat de effecten van DBT orgaanselectief lijken te zijn, waarbij functies worden beïnvloed die relevant zijn voor de gezondheid in de menopauze. Wat de veiligheid betreft waren er geen aanwijzingen voor oestrogeenafhankelijke stimulering van de proliferatie in organen van het voortplantingskanaal. Wat de werkzaamheid betreft, vertoont DBT zwakke oestrogene eigenschappen en reguleert het de expressie van functioneel met elkaar verbonden lipidensensoren, waaronder de PPAR- en AhR-moleculenfamilies, waarbij de laatste een verband legt met ontgifting en energiemetabolisme. Wij stellen de hypothese dat DBT daarom eigenschappen kan hebben die direct en indirect van invloed zijn op de gezondheid tijdens de menopauze.

Afkortingen

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van Research Grants Council of Hong Kong (HKUST 6419/06 M en N_HKUST629/07, 662608), Croucher Foundation (CAS-CF07/08.SC03) aan Karl W. K. Tsim, en Duitse Onderzoeksstichting (DFG Vo410/6-5) en Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD 50023165) aan Günter Vollmer. De medewerkers van de TU-Dresden erkennen de steun van de Duitse Onderzoeksstichting en de Open Access Publication Funds van de TU-Dresden.

Aanvullend materiaal