FOOD MICROBIOLOGY
Isolatie van bacteriocineproducerende melkzuurbacteriën uit vlees en vleesproducten en hun spectrum van remmende activiteit
Isolamento de bactérias lácticas produtoras de bacteriocinasproducerende melkzuurbacteriën uit vlees en vleesproducten en hun spectrum van remmende activiteit
Isolamento de bactérias lácticas produtoras de bacteriocinas a partir de carnes e produtos cárneos e seu espectro de atividade inibitória
Renata Bromberg; Izildinha Moreno; Cíntia Lopes Zaganini; Roberta Regina Delboni; Josiane de Oliveira
Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas, SP, Brasil
Correspondentie
ABSTRACT
Een totaal van 285 monsters van vlees en vleesproducten werd geëvalueerd op de aanwezigheid van bacteriocineproducerende melkzuurbacteriën door middel van de “sandwich” test. Uit 174 van deze monsters werden 813 stammen van melkzuurbacteriën geïsoleerd. Zij waren in staat de groei van Staphylococcus aureus CTC 33 en/of Listeria innocua Lin 11 te remmen. Bij evaluatie met de well-diffusion assay remden 128 van deze stammen de groei van de indicatorstammen. De remmingsspectra van de isolaten werden geëvalueerd tegen een reeks Gram-positieve en Gram-negatieve testorganismen. S. aureus was de gevoeligste geteste indicator, terwijl Enterococcus faecalis en Lactobacillus plantarum de meest resistente waren. Alle door de melkzuurbacteriën geproduceerde verbindingen werden geheel of gedeeltelijk geïnactiveerd door sommige proteolytische enzymen, hetgeen wijst op hun proteolytische aard. De antimicrobiële activiteit van de bacteriocines geproduceerd door de melkzuurbacteriën geïsoleerd in dit werk zou kunnen fungeren als een potentiële barrière om de groei van bederfveroorzakende bacteriën en door voedsel overgedragen ziekteverwekkers te remmen.
Key words: bacteriocins, melkzuurbacteriën, vlees, remmende activiteit.
RESUMO
Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do “sanduíche”. Uit 174 van deze monsters werden 813 stammen van melkzuurbacteriën geïsoleerd met remmende activiteit op Staphylococcus aureus CTC 033 en/of Listeria innocua Lin 11. Bij onderzoek met de simultaan-antagonisme-methode in putjes remden 128 van deze stammen de groei van de indicator-micro-organismen. Het werkingsspectrum van de geïsoleerde stammen werd geëvalueerd met verschillende Gram-positieve en Gram-negatieve micro-organismen. In het algemeen was S. aureus het meest gevoelige indicator micro-organisme, terwijl Enterococcus faecalis en Lactobacillus plantarum het meest resistent waren. Alle antimicrobiële verbindingen die door de geteste melkzuurbacteriën werden geproduceerd, werden geheel of gedeeltelijk geïnactiveerd door proteolytische enzymen, wat wijst op hun proteïnerend karakter. De antimicrobiële activiteit van bacteriocines, geproduceerd door de melkzuurbacteriestammen die in dit werk werden geïsoleerd, kan een potentiële barrière vormen om de groei van bederfveroorzakende en voedselpathogene bacteriën tegen te gaan.
Palavras-chave: bactérias lácticas, bacteriocinas, carne, atividade inibitória.
INLEIDING
Recentelijk zijn pogingen ondernomen om biopreservatietechnieken toe te passen op vleesproducten (18). Daarbij is een concurrerende microflora van melkzuurbacteriën geïntroduceerd als beschermcultuur voor vleesproducten, waaronder bacteriocineproducerende melkzuurbacteriën en gezuiverde anti-listeriële bacteriocines (12). Aangezien bacteriocineproducerende bacteriën worden geïsoleerd uit voedingsmiddelen die normaal melkzuurbacteriën bevatten, zoals vlees en zuivelproducten, worden zij reeds lange tijd geconsumeerd. Bacteriocines geproduceerd door melkzuurbacteriën worden gedefinieerd als extracellulair geproduceerde primaire of gemodificeerde producten van bacteriële ribosomale synthese, die een betrekkelijk nauw spectrum van bactericide activiteit kunnen hebben (4). Bacteriocineproducerende stammen kunnen worden gebruikt als onderdeel van of als aanvulling op starterculturen voor gefermenteerde levensmiddelen om de veiligheid en kwaliteit te verbeteren. In dit verband hebben bacteriocines die worden geproduceerd door melkzuurbacteriën die met vlees worden geassocieerd, zoals Pediococcus, Leuconostoc, Carnobacterium en Lactobacillus spp. waarschijnlijk een veel groter potentieel als conserveermiddel voor vlees (3,31,33,38). De mogelijkheid om bacteriocines bij de fermentatie van levensmiddelen te gebruiken, ontstaat wanneer het remmende spectrum voedselbedervende en/of pathogene micro-organismen omvat, waardoor de producerende stam een concurrentievoordeel in het levensmiddel krijgt. Een belangrijk voordeel van bacteriocines ten opzichte van klassieke antibiotica is dat ze door de spijsverteringsenzymen worden vernietigd (4). Dit feit wijst erop dat de inname van deze verbindingen de ecologie van het spijsverteringskanaal niet zal veranderen en ook geen risico’s zal veroorzaken die verbonden zijn aan het gebruik van gewone antibiotica.
Bacteriocines zouden kunnen worden toegepast in de “hurdle technology”, waarbij gebruik wordt gemaakt van de synergieën van gecombineerde behandelingen om voedsel doeltreffender te conserveren (6). Het gebruik van nisine, een bacteriocine geproduceerd door Lactococcus lactis ssp., is thans in ongeveer 50 landen toegestaan. Sommige onderzoekers kwamen echter tot de conclusie dat nisine niet doeltreffend is bij de toepassing in vlees vanwege de hoge pH (24), de moeilijkheid om de bacteriocine gelijkmatig over het voedsel te verdelen en interferentie door vleesbestanddelen zoals fosfolipiden (8) en glutathion (26). Gezien de moeilijkheden bij het gebruik van nisine in vleestoepassingen, moet het zoeken naar nieuwe bacteriocineproducerende culturen worden voortgezet.
Het doel van deze studie was een reeks vlees en vleesproducten te screenen op de aanwezigheid van bacteriocineproducerende stammen die waardevol zouden kunnen zijn voor gebruik in biopreservatiestrategieën voor vleesproducten. Zo werd het potentieel van de isolaten om voedselbederf en door voedsel overgedragen pathogene bacteriën te remmen, geëvalueerd.
MATERIALEN EN METHODEN
Bacteriestammen en groeimedia
De in deze studie gebruikte stammen staan vermeld in tabel 1. De als indicatoren gekozen bacteriën waren Staphylococcus aureus CTC 33 (Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL, Campinas, Brazilië), Listeria innocua Lin 11 (Pasteur-Instituut, Parijs, Frankrijk), en Bacillus cereus CTC 1 (ITAL). De bacteriocineproducerende Lactobacillus casei LC 705 (Wiesby) werd gebruikt als positieve controle. De stamculturen van melkzuurbacteriën en de andere micro-organismen werden bij -80ºC bewaard in de Man Rogosa Sharpe bouillon (MRS, Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) of in Trypticase Soya bouillon (TSB, Oxoid) aangevuld met 15% glycerol. Werkculturen werden bereid als slants op MRS agar voor melkzuurbacteriën of TSA agar met 0,6% gistextract (Oxoid) supplement voor de indicatoren, en bewaard bij 4ºC. Culturen voor experimenten werden eenmaal per week gestreept en geënt in media van een enkele kolonie en geïncubeerd gedurende 24 uur. Vóór gebruik werden de melkzuurbacterieculturen tweemaal overgebracht in het geschikte medium en geïncubeerd volgens de voorwaarden van tabel 1.
Monsters
Tweehonderdvijfentachtig monsters van een verscheidenheid aan vlees en vleesproducten, verkregen van verschillende Braziliaanse fabrikanten, werden geanalyseerd. Het ging om vers vlees, rauw, gekookt, gerijpt, gedroogd of gefermenteerde vleesproducten. Na aankoop in de detailhandel werden alle monsters tot maximaal 24 uur voor de analyse bewaard bij 3 ± 1ºC.
Ontdekking van bacteriocineproducerende melkzuurbacteriën uit vlees
Een portie van 25 g van elk vleesmonster werd aseptisch overgebracht in een steriele stomacherzak en 225 mL gebufferd peptonwater (BPW, Oxoid) werd toegevoegd om een verdunning van 1:10 te verkrijgen. De monsters werden gedurende 1 min gemengd met een stomacher (model 400 – BA 7021, Seward Medical, Londen, VK). Seriële verdunningen van de monsters werden gemaakt in 0,1% peptonwater. Voor de detectie van antagonistische activiteit werd een “sandwich”-test gebruikt (37). Daartoe werden de verdunningen geënt (gietplaat) op MRS-agar aangevuld met 0,01% natriumazide om Gram-negatieve bacteriën te remmen. De remmende activiteit van het waterstofperoxide werd geëlimineerd door toevoeging van katalase (Sigma Chemical Co., Dorset, UK) in een eindconcentratie van 100 U. Om remming door pH-verlaging ten gevolge van organische zuurproductie uit te sluiten, werd 2% natrium-b-glycerofosfaat (Ecibra, Brazilië) aan MRS-agar toegevoegd. De platen werden overgoten met hetzelfde medium om remming door lytische bacteriofagen uit te sluiten, die niet-verspreidende entiteiten zijn, gevolgd door aërobe incubatie bij 35ºC gedurende 48 uur om de kolonies de kans te geven zich te ontwikkelen.
Na de incubatieperiode werden platen met maximaal 102 CFU overgoten met 4,5 ml zachte TSB (met 0,75% agar). De overdekte agar werd bezaaid met 500 ml S. aureus CTC 33 of L. innocua Lin 11 op een niveau van 106 tot 107 CFU/mL. De platen werden gedurende 24 uur geïncubeerd bij 35ºC. Lysis van de indicatorstammen resulteerde in een duidelijke zone. Kolonies met remmingszones werden overgebracht op TSB en geïncubeerd bij 30ºC gedurende maximaal 72 uur. De culturen werden gezuiverd op MRS-agarplaten en geïncubeerd bij 30ºC gedurende 18 uur. De gezuiverde isolaten werden onderzocht met Gram-kleuring en katalaseproductie, bepaald volgens Harrigan en McCance (10).
Opsporing van antagonistische activiteit
De bacteriocineproductie door de melkzuurbacteriën geïsoleerd uit vlees en vleesproducten werd bepaald met de agar-wel-diffusiemethode volgens Benkerroum et al. (1), een modificatie van de methode beschreven door Tagg en McGiven (35). De platen werden gedurende in totaal 24 uur met verschillende tussenpozen onderzocht op lysis rond de putjes. Er werd een directe vergelijking gemaakt tussen de diameters van de door de verschillende stammen geproduceerde remmingszones.
Bacteriocinespectrum van remmende activiteit
Bacteriocineproducerende culturen, geïsoleerd uit vlees en vleesproducten, werden ook getest tegen de in tabel 1 vermelde bacteriestammen. De well-diffusion assay werd gebruikt zoals eerder beschreven. De stammen die een breed werkingsspectrum vertoonden, werden ook onderzocht met de kritische verdunningstest van Mayr-Harting et al. (19). De titel werd gedefinieerd als de reciproke van de hoogste verdunning die een remming van de indicatorstam vertoonde, vermenigvuldigd met 100 om de resultaten uit te drukken in activiteitseenheden per milliliter (AU/mL).
Gevoeligheid van bacteriocine-achtige stof voor enzymen
Celvrije supernatanten van de melkzuurcultures werden verzameld door centrifugatie (7.500 g, 10 min, 4ºC) van nachtelijke MRS-bouilloncultures. De supernatantvloeistoffen werden op pH 6,5 gebracht met 10 N NaOH en blootgesteld aan hitte (95ºC gedurende 5 min) in een kokend waterbad. De supernatanten werden behandeld met de volgende enzymen in een eindconcentratie van 0,2 mg/ml: ficine (Sigma Chemical Co, Dorset, Engeland) in 20 mM natriumfosfaat, pH 7,0; trypsine (Sigma) in 40 mM Tris-HCl, pH 8,2; a-chymotrypsine (Sigma) in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; pronase E (Sigma) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,0; pepsine (Merck) in 40 mM Tris-HCl, pH 8,2; a-chymotrypsine (Sigma) in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0.8; pepsine (Merck Darmstad, Duitsland) in 0,002 N HCl; lipase (Merck) in 0,1 M kaliumfosfaat, pH 6,0; papaïne (Sigma) in 0,05 M natriumfosfaatacetaat, pH 7,0. Al deze oplossingen werden gesteriliseerd door Millex GV 0,22 m filters (Millipore S.A., St. Quentin-en-Yvelines, Frankrijk) en vervolgens toegevoegd aan steriele celvrije supernatanten (v/v, 1/1). De controles bestonden uit enzymoplossingen zonder bacteriocine en alleen celvrij supernatant in 0,1 M natriumfosfaatbuffer. De monsters en controles werden gedurende 2 uur bij 37ºC geïncubeerd en vervolgens gedurende 5 minuten in kokend water verwarmd om de enzymen te inactiveren. De resterende bacteriocineactiviteit werd bepaald met de kritische verdunningstest van Mayr-Harting et al. (19) zoals eerder beschreven, met B. cereus CTC 1 als indicatorstam.
RESULTATEN EN DISCUSSIE
Bacteriële isolatie en screening
Omdat bacteriocineproducerende bacteriën geïsoleerd uit vlees en producten goed aangepast zijn aan deze omstandigheden, zouden ze de veiligheid kunnen verzekeren en de houdbaarheid van deze voedingsmiddelen verlengen. Daarom werd gezocht naar antagonistische activiteiten tegen voedselbederf en pathogene bacteriën, in isolaten van een reeks vlees- en vleesproducten.
Van een totaal van 285 verschillende geanalyseerde monsters van vers vlees en vleesproducten, vertoonden 174 stammen van melkzuurbacteriën die bacteriocine-achtige stoffen bleken te produceren met de “sandwich” test. Uit elk van deze monsters werden ten minste 4 kolonies geïsoleerd die S. aureus CTC 33 en/of L. innocua Lin 11 konden remmen, wat neerkomt op een totaal van 813 kolonies. De Martinis et al. (7) onderzochten twintig monsters van Braziliaans vlees en vleesproducten en isoleerden vier bacteriocineproducerende melkzuurbacteriën die antilisteriële activiteit vertoonden.
Na zuivering werden de culturen vervolgens gecontroleerd op bacteriocineproductie met behulp van de well-diffusion assay. Met deze methode, waarbij de putjes worden geïnoculeerd met bouillonculturen van verschillende indicator-micro-organismen, kan de bacteriocineproduktie van verschillende stammen die onder identieke omstandigheden groeien, worden vergeleken. Van de 813 isolaten produceerden er slechts 128 (15,7%) remmingszones op MRS-agar. Deze bacteriocineproducerende stammen waren allemaal Gram-positief en catalase-negatief; 75,8% waren cocci en 24,2% staafjes. Schillinger en Lücke (28) verkregen soortgelijke resultaten bij het controleren van Lactobacillus sake stammen die positief waren bij de agar spot test en negatief bij de well-diffusion assay: van een totaal van 19 stammen produceerden slechts zes inhibitiezones op agar bij de well-diffusion assay. Lewus et al. (16) vonden dat slechts enkele van de stammen die positief testten met de spot-on-the-lawn-methode, positieve resultaten gaven bij de well-diffusion assay. Zij waren van mening dat de gevoeligheid van de test zou kunnen worden vergroot door de bacteriocines vóór de incubatie enige tijd de tijd te geven om in de agar te diffunderen of door de putjes groter te maken zodat meer monster kan worden aangebracht. Volgens deze auteurs kunnen aggregatie, niet-verspreidbare bacteriocinen, protease-inactivering en concentratie-effecten alle leiden tot vals-negatieve resultaten in de well-diffusion assay.
De resultaten van de well-diffusion assay toonden aan dat 64,1% van de geïsoleerde stammen alleen S. aureus remden, en 11,7% alleen remmende activiteit vertoonde tegen L. innocua, terwijl 24,2% van de vleesisolaten die S. aureus remden, ook L. innocua remden. Volgens Lewus et al. (16) moet het indicatormicro-organisme dat in de initiële screening wordt gebruikt, de uiteindelijke of voorgestelde toepassing van de bacteriocineproducerende stam weerspiegelen. S. aureus en Listeria sp. zijn vaak aanwezig in verse weefsels, omdat het slachtproces geen bacteriedodende stap omvat. De groei van S. aureus in levensmiddelen vormt een potentieel gevaar voor de volksgezondheid, aangezien veel stammen van S. aureus enterotoxinen produceren die bij inname voedselvergiftiging veroorzaken. Vlees en vleesproducten worden vaak in verband gebracht met stafylokokken-voedselvergiftiging (25,36). Listeria-soorten zijn aangetroffen in vlees en vleesproducten (13). Overdracht van L. monocytogenes via voedsel is in verband gebracht met uitbraken van listeriose bij de mens waarbij diverse levensmiddelen werden geconsumeerd (9,17,29). L. innocua wordt vaak uit vlees geïsoleerd, en vaak is de incidentie van dit organisme hoger dan die van L. monocytogenes (2). Het gebruik van andere Listeria-soorten dan L. monocytogenes als indicator voor de aanwezigheid van dit organisme is voorgesteld (39).
Fig. 1 toont de groepen van vlees- en vleesproductmonsters die bacteriocine-achtige melkzuurbacteriën vertoonden, volgens de “sandwich” test en de well-diffusion assay. Niet alle bacteriën die met de “sandwich” test geïsoleerd werden, werden echter bevestigd in de well-diffusion assay. De “sandwich”-test leverde 174 (61,0%) positieve monsters op voor bacteriocineproducerende organismen, waarvan er slechts 55 (31,1%) positief testten bij de putdiffusiebepaling. Volgens de “sandwich”-test werd het merendeel van de bacteriocineproducerende bacteriën geïsoleerd uit gerijpte, gedroogde of gefermenteerde vleesprodukten (78,4%). Hetzelfde werd niet waargenomen bij de “well-diffusion assay”: vers vlees had het hoogste aantal bacteriocineproducerende bacteriën (27,5%). Anderzijds toonden beide methoden aan dat gekookte vleesproducten minder monsters bevatten met melkzuurbacteriën die positief waren voor bacteriocine-achtige stoffen.
Deze negatieve resultaten zouden kunnen aantonen dat de bacteriocineproductie niet sterk geconserveerd is bij deze stammen. Sommige van de bacteriocines zijn plasmide-gemedieerde proteïnen (34), zodat men rekening moet houden met de mogelijkheid dat sommige culturen hun plasmiden hebben verloren na opeenvolgende transfers tijdens de zuivering.
Spectra van remmende activiteit
De activiteit tegen 18 indicatorstammen, van de door de bacterie-isolaten geproduceerde antibacteriële verbindingen, wordt weergegeven in (Tabel 2). Deze stammen vertoonden een breed remmingsspectrum, aangezien zij in staat waren veel van de geteste indicatorstammen te remmen. Deze gegevens suggereren dat verschillende indicator-micro-organismen moeten worden gebruikt in bacteriocine-screening-tests, om te voorkomen dat een producent wordt gemist. Van alle geteste indicatorstammen waren S. aureus CTC 33, Cl. sporogenes CTC 6 en B. cereus CTC 1 het gevoeligst en werden ze door het grootste aantal culturen geremd, terwijl Ent. faecalis ATCC 19433, Lb. plantarum TECNOLAT 434, sulfietreducerende clostridia CTC 5, Leuc. mesenteroides ATCC 10830 en W. viridescens CCT 849 door een klein aantal stammen werden geremd. Van de stammen die op bacteriocineproductie werden getest, vertoonde geen enkele een remmende activiteit tegen alle indicatoren. Slechts 4 stammen (CTC 165, CTC 376, CTC 469, en CTC 484), remden de meerderheid van de geteste indicatorstammen (gegevens niet aangetoond).
De meerderheid van de remming veroorzaakt door melkzuurstammen produceerde “lage” remmingszones (straal van de klaringszone was kleiner dan 3 mm). Lb. helveticus (Wiesby) was een zeer gevoelige indicator, aangezien 90,2% van de remming veroorzaakt door de bacteriocines getest op deze bacterie “hoge” remmingszones opleverde (straal van de klaringszone was groter dan 5 mm). De culturen die “hoge” remmingszones produceerden tegen indicatorstammen waren: CTC 3, CTC 12, CTC 35, CTC 36, CTC 38, CTC 40, CTC 49, CTC 51, CTC 78, CTC 141, CTC 142, CTC 144, CTC 172, CTC 176, CTC 185, CTC 204, CTC 205, CTC 206, CTC 210, CTC 211, CTC 212, CTC 231, CTC 253, CTC 330, CTC 346, CTC 352, CTC 359, CTC 375, CTC 376, CTC 377, CTC 378, CTC 396, CTC 404, CTC 469, CTC 483, CTC 484, en CTC 485 tegen Lb. helveticus; stammen CTC 78 en CTC 172 tegen B. cereus CTC 001; stam CTC 172 tegen Cl. sporogenes CTC 006; en stam CTC 332 tegen Cl. perfringens CTC 42.
Sommige stammen produceerden bacteriocine-achtige stoffen die de geteste Gram-negatieve bacteriën remden: Pseudomonas sp. CTC 32 werd geremd door 61 (47,6%) stammen, E. coli ATCC 25422 door 49 (38,3%) stammen, en Salm. typhimurium ATCC 14028 door 48 (37,5%) stammen. Het doelwit van bacteriocines is het cytoplasmamembraan, zodat bacteriocines, als gevolg van de beschermende barrière die wordt gevormd door het LPS van het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën, over het algemeen alleen werkzaam zijn tegen Gram-positieve cellen (32). Mutantstammen of protoplasten van Gram-negatieve bacteriën werden echter gevoelig voor de werking van bacteriocinen na blootstelling aan subletale stress zoals verhitting, bevriezing of ontdooiing, waardoor het buitenmembraan wordt verstoord en bacteriocinen toegang krijgen tot het cytoplasmamembraan, hetgeen leidt tot een verhoogde gevoeligheid (11,30,32).
Van de 128 op antimicrobiële activiteit geteste culturen werden de 12 die het grootste aantal indicatoren remden, getest met de Mayr-Harting et al. (19) assay (tabel 3). Volgens de resultaten waren B. cereus CTC 1 en L. monocytogenes CTC 21 de meest gevoelige geteste micro-organismen, aangezien de geanalyseerde melkzuurstammen respectievelijk 100% en 91,7% van hen remden. De remmingsgraad van de geteste indicatorstammen varieerde. W. viridescens CCT 849 was de meest resistente stam, aangezien deze de laagste activiteitswaarde vertoonde. B. cereus ATCC 14579, Leuc. mesenteroides ATCC 10830, en de sulfietreducerende clostridia CCT 5, vertoonden een intermediair gevoeligheidspatroon, terwijl S. aureus CTC 33, L. innocua Lin 11, L. monocytogenes CTC 21, en Cl. perfringens CTC 42 minder resistente bacteriën waren. De meest gevoelige micro-organismen, B. cereus CTC 1, Ent. faecalis ATCC 19433, en Lb. helveticus (Wiesby) vertoonden de hoogste gevoeligheid tegen enkele van de producenten. Bij de producenten vertoonden de stammen CTC 210 en CTC 404 lagere remmingswaarden, terwijl de stammen CTC 469, CTC 483 en CTC 485 de hoogste activiteit vertoonden. Van de geteste stammen vertoonden CTC 164 en CTC 469 het breedste activiteitsspectrum, aangezien zij in staat waren 44,4% van de indicatorculturen te remmen.
Enkele van de micro-organismen die gevoeligheid vertoonden voor de met de put-diffusietest geteste stammen, zoals de Gram-negatieve soorten (E. coli ATCC 25422, Pseudomonas sp. CTC 32, en Salm. typhimurium ATCC 14028), Cl. sporogenes CTC 6, Micrococcus sp. ATCC 4698, Lb. plantarum TECNOLAT 434, en Streptococcus sp. ATCC 25175, werden niet geremd in de Mayr-Harting et al. (19)-test. Alleen B. cereus CTC 1 vertoonde hetzelfde patroon van gevoeligheid wanneer geanalyseerd met beide methoden.
De remming van de indicatorculturen was groter bij gebruik van de put-diffusie-test. Aangezien zowel de producentenculturen als de indicatorculturen gelijktijdig groeiden, zou de remming kunnen worden veroorzaakt door een competitie om voedingsstoffen uit de kweekmedia. Het gebruik van celvrije supernatanten in de Mayr-Harting et al. (19) assay zou dit probleem kunnen vermijden.
Gevoeligheid voor proteolytische en lipolytische enzymen
De gevoeligheid van de door melkzuurbacteriën geproduceerde antibacteriële stoffen voor a-chymotrypsine, trypsine, pronase E, ficine, pepsine, papaïne en lipase werd bepaald onder gecontroleerde en reproduceerbare omstandigheden zoals weergegeven in (tabel 4). Alle verbindingen werden geheel of gedeeltelijk geïnactiveerd door sommige van de proteolytische enzymen, wat wijst op hun eiwitachtige aard.
In het algemeen vertoonden de remmende verbindingen, geproduceerd door deze stammen, verschillende patronen van gevoeligheid. Allen werden volledig geïnactiveerd door a-chymotrypsine, pronase E, en ficine. Slechts één stam was resistent tegen trypsine (stam CTC 141), terwijl de door stam CTC 204 geproduceerde stof 75% van zijn activiteit verloor na behandeling met dit enzym. Sommige auteurs onderscheiden nisine van andere lactococcen-bacteriocinen door het feit dat a-chymotrypsine het enige proteolytische enzym is waarvoor nisine gevoelig is (14,22). Deze eigenschap moet echter met voorzichtigheid worden beschouwd, omdat andere auteurs hebben gemeld dat nisine ook door andere enzymen kan worden geïnactiveerd, zoals pronase E (15,23), en ficine (5,21).
Pepsine remde de antagonistische activiteit van 75% van de stammen (CTC 141, CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 396, CTC 404, CTC 483, CTC 484, en CTC 485). Gevoeligheid voor pepsine werd aangetoond bij andere bacteriocines: plantaricine 35d (20), sakacine A (28), en enterocine 416KI (27). Papaïne had geen invloed op de activiteit van de antibacteriële stoffen die door de stammen CTC 141 en CTC 404 werden geproduceerd, terwijl dit enzym de andere inactiveerde.
De verbindingen geproduceerd door de stammen CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 483, CTC 484, en CTC 485, werden geheel of gedeeltelijk geïnactiveerd na behandeling met lipase, wat erop wijst dat deze remmende stoffen mogelijk een lipidegedeelte in hun chemische samenstelling hebben.
Het is interessant op te merken dat de door deze stammen geproduceerde verbindingen werden geïnactiveerd door een reeks proteolytische enzymen, waaronder die van pancreas-oorsprong (trypsine en a-chymotrypsine) en vele malen van maag-oorsprong (pepsine). Op basis van de definitie van bacteriocines van Gram-positieve bacteriën van Tagg e.a. (34) en Klaenhammer (14) en met gebruikmaking van de eigenschappen die zijn waargenomen bij bacteriocines van melkzuurbacteriën (22), kunnen de door de huidige stammen geproduceerde antibacteriële verbindingen worden geclassificeerd als bacteriocines. Het patroon van proteasegevoeligheid wijst op de eigenaardigheid van de door de isolaten geproduceerde bacteriocines en op het feit dat de stammen verschillend zijn. Hoewel sommige van de bacteriocines een vergelijkbaar patroon van proteasegevoeligheid vertoonden, zoals tussen CTC 210 en CTC 484 of CTC 352 en CTC 469, deelden zij niet een identiek spectrum van activiteit.
De resultaten toonden aan dat 61% van de geanalyseerde vleesmonsters bacteriocineproducerende melkzuurbacteriën vertoonden met het potentieel om schadelijke micro-organismen te remmen, zoals L. monocytogenes, S. aureus, en sporulerende bacteriën. De antimicrobiële activiteit van de bacteriocines die geproduceerd worden door de melkzuurbacteriën die in dit onderzoek geïsoleerd zijn, zou als barrière kunnen fungeren om voedselbederf en/of de groei van pathogene micro-organismen in voedsel tegen te gaan. Verdere werkzaamheden om de aard van deze stoffen en hun toepasbaarheid in bioconserveringstechnieken voor vlees te evalueren, zijn aan de gang.
ACKNOWLEDGEMENTS
De auteurs danken FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) voor financiële steun (Proces 99/12314-0).
1. Benkerroum, N.; Ghouati, Y.; Sandine, W.E.; Tantaoui-Elaraki, A. Methoden om de bactericide activiteit van bacteriocines aan te tonen. Letters Appl. Microbiol., 17: 80-81, 1993.
2. Breer, C.; Schopfer, K. Listeria and food. Lancet ii, 1022, 1988.
3. Campanini, M.; Pedrazzoni, I.; Barbuti, S.; Baldini, P. Gedrag van Listeria monocytogenes tijdens de rijping van natuurlijk en kunstmatig besmette salami: effect van starterculturen van melkzuurbacteriën. Int. J. Food Microbiol., 20: 169-175, 1993.
4. Caplice, E.; Fitzgerald, G.F. Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. Int. J. Food Microbiol., 50(1-2): 131-149, 1999.
5. Carminati, D.; Giraffa, G.; Bossi, M. Bacteriocine-achtige remmers van Streptococcus lactis tegen Listeria monocytogenes. J. Food Prot., 52(9): 614-617, 1989.
6. Cleveland, J.; Montville, T.J.; Nes, I.F.; Chikindas, M.L. Bacteriocins: safe, natural, antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol., 71: 1-20, 2001.
7. De Martinis, E.C.P.; Públio, M.R.P.; Santarosa, P.R.; Freitas, F.Z. Antilisterial activity of lactic acid bacteria isolated from vacuum-packed Brazilian meat ant meat products. Braz. J. Microbiol., 32(1): 32-37, 2001.
8. De Vuyst, L.; Vandamme, E. Nisin, een lantibioticum geproduceerd door Lactococcus lactis subsp. lactis: eigenschappen, biosynthese en toepassingen. In: De Vuyst, L.; Vandamme, E. (eds.). Bacteriocines van melkzuurbacteriën. Microbiologie, genetica en toepassingen. Blackie Academic and Professional, Londen, 1994, p.151-221.
9. Fleming, D.W.; Cochi, S.L.; MacDonald, K.L.; Brondum, J.; Hayes, P.S.; Plikaytis, B.D.; Holmes, M.B.; Audurier, A.; Broomer, C.V.; Reingold, A.L. Gepasteuriseerde melk als infectiehaard bij een uitbraak van listeriose. N. Engl. J. Med., 312: 404-407, 1985.
10. Harrigan, W.F.; McCance, M.E. Basic methods. In: Harrigan, W.F.; McCance, M.E. (eds.). Laboratoriummethoden in de microbiologie van voeding en zuivel. Academic Press, Londen, 1976, p.1-115.
11. Hauben, K.; Wuytack, E.; Soontjens, C.C.F.; Michiels, C.W. High-pressure transient sensitization of Escherichia coli to lysozyme and nisin by disruption of outer-membrane permeability. J. Food Prot., 59: 350-355, 1996.
12. Hugas, M.; Monfort, J.M. Bacteriële starterculturen voor vleesfermentatie. Food Chem., 59(4): 547-554, 1997.
13. Johnson, J.L.; Doyle, M.P.; Cassens, R.G. Listeria monocytogenes en andere Listeria spp. in vlees en vleesproducten. Een overzicht. J. Food Prot., 53(1): 81-91, 1990.
14. Klaenhammer, T.R. Bacteriocines van melkzuurbacteriën. Biochimie, 70: 337-349, 1988.
15. Kojic, M.; Svircevic, J.; Banina, A.; Topisirovic, L. Bacteriocineproducerende stam van Lactococcus lactis subsp. diacitilactis S50. Application. Environ. Microbiol., 57(6): 1835-1837, 1991.
16. Lewus, C.B.; Kaiser, A.; Montville, T.J. Inhibition of food-borne pathogens by bacteriocins from lactic acid bacteria isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol., 57(6): 1683-1688, 1991.
17. Linnan, M.J.; Mascola, L.; Lou, X.D.; Goulet, V.; May, S.; Salminen, C.; Hird, D.W.; Yonekura, M.L.; Hayes, P.; Weaver, R.; Audurier, A.; Plikaytis, B.D.; Fannin, S.L.; Kleks, A.; Broome, C.V. Epidemische listeriose geassocieerd met Mexicaansche kaas. N. Engl. J. Med., 319: 823-828, 1988.
18. Lücke, F-K. Utilisation of microbes to process and preserve meat. Meat Sci., 56: 105-115, 2000.
19. Mayr-Harting, A.; Hedges, A.J.; Berkeley, C.W. Methods for studying bacteriocins. In: Norris, J.R.; Ribbons, D.W. (eds.). Methoden in de Microbiologie. Academic Press Inc., New York, 1972, p.316-422.
20. Messi, P.; Bondi, M.; Sabia, C.; Battini, R.; Manicardi, G. Detection and preliminary characterization of a bacteriocin (plantaricin 35d) produced by a Lactobacillus plantarum strain. Int. J. Food Microbiol., 64: 193-198, 2001.
21. Moreno, I.; Lerayer, A.L.S.; Baldini, V.L.S.; Leitão, M.F.F. Karakterisering van bacteriocines geproduceerd door Lactococcus lactis stammen. Braz. J. Microbiol., 31(3): 184-192, 2000.
22. Piard, J.C.; Desmazeaud, M. Inhibitiefactoren geproduceerd door melkzuurbacteriën. 2. Bacteriocines en andere antibacteriële stoffen. Lait, 72: 113-142, 1992.
23. Rammelsberg, M.; Radler, F. Antibacteriële polypeptiden van Lactobacillus species. J. Appl. Bacteriol., 69: 177-184, 1990.
24. Rayman, K.; Malik, N.; Hurst, A. Falen van nisine in het remmen van uitgroei van Clostridium botulinum in een model gezouten vlees systeem. Appl. Environ. Microbiol, 46: 1450-1452, 1983.
25. Roberts, D. Bacteriën van belang voor de volksgezondheid. In: Brown, M.H. (ed.) Vleesmicrobiologie. Applied Science Publishers Ltd., Londen, 1982, p.319-386.
26. Rose, N.L.; Sporns, P.; Stiles, M.E.; McMullen, L.M. Inactivering van nisine door glutathion in vers vlees. J. Food Sci., 64(5): 759-762, 1999.
27. Sabia, C.; Manicardi, G.; Messi, P.; Niederhäusern, S.; Bondi, M. Enterocin 416K1, an antilisterial bacteriocin produced by Enterococcus casseliflavus IM 416K1 isolated from Italian sausages. Int. J. Food Microbiol., 75: 163-170, 2002.
28. Schillinger, U.; Lücke, F-K. Antibacteriële activiteit van Lactobacillus sake geïsoleerd uit vlees. Appl. Environ. Microbiol., 55(8): 1901-1906, 1989.
29. Schlech, W.F.; Lavigne, P.M.; Bortolussi, R.A.; Allen, A.C.; Haldane, E.V.; Wort, A.J.; Hightower, A.W.; Johnson, S.E.; King, S.H.; Nicholls, E.S.; Broome, C.V. Epidemic listeriosis-evidence for transmission by food. N. Eng. J. Med., 308: 203-204, 1983.
30. Schved, F.; Henis, Y.; Juven, B.J. Response of spheroplasts and chelator-permeabilized cells of Gram-negative bacteria to the action of the bacteriocin pediocin SJ-1 and nisin. Int. J. Food Microbiol., 21: 305-314, 1994.
31. Shahidi, F. Developing alternative meat-curing systems. Trends Food Sci. Technol., 2: 219-222, 1991.
32. Stevens, K.A.; Sheldon, B.W.; Klapes, N.A.; Klaenhammer, T.R. Nisine treatment for inactivation of Salmonella species and other Gram-negative bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 57: 3613-3615, 1991.
33. Stiles, M.E.; Hastings, J.W. Bacteriocin production by lactic acid bacteria: Potential for use in meat preservation. Trends Food Sci. Technol., 2: 247-251, 1991.
34. Tagg, J.R.; Dajani, A.S.; Wannamaker, L.W. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol. Rev., 40: 722-756, 1976.
35. Tagg, J.R.; McGiven, A.R. Assay system for bacteriocins. Appl. Microbiol., 21(5): 943, 1971.
36. Varnam, A.H.; Sutherland, J. Gekookt gezouten vlees. In: Varnam, A.H.; Sutherland, J.P. (eds.). Vlees en vleesproducten. Technologie, chemie en microbiologie. Chapman & Hall, Londen, 1995, p.298-313.
37. Yang, R.; Ray, B. Prevalentie en biologische controle van bacteriocineproducerende psychrotrofe leuconostocs geassocieerd met bederf van vacuümverpakt verwerkt vlees. J. Food Prot., 57(3): 209-217, 1994.
38. Yousef, A.E.; Luchansky, J.B.; Degnan, A.K.; Doyle, M.P. Gedrag van Listeria monocytogenes in Wiener exsudaten in aanwezigheid van Pediococcus acidilactici H of pediocin AcH tijdens opslag bij 4 of 25ºC. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1461-1467, 1991.
39. World Health Organization Informal Working Group on Foodborne Listeriosis. Door voedsel overgedragen listeriose. Document n° WHO/WHE/FOS/88.5. Wereldgezondheidsorganisatie: Genève, Zwitserland, 1988.