Rajskub’s eerste rol was die van Oompa-Loompa in een gemeenschapstheaterproductie van Willy Wonka & de Chocoladefabriek, en haar eerste hoofdrol was die van Raggedy Ann. In 1996 verscheen ze in muziekvideo’s voor de nummers “The Good Life” van Weezer en “The New Pollution” van Beck.
Van 1996-1998 had ze een terugkerende rol in de HBO-serie The Larry Sanders Show als boekingsassistente Mary Lou Collins.
Haar meest opmerkelijke rol is CTU-systeemanalist Chloe O’Brian op 24, waar ze in 2003 aan het begin van het derde seizoen van de show aan meedeed. Haar personage was een hit bij kijkers en critici en was een van de weinige castleden die terugkeerde in het vierde seizoen van de show. Na twee seizoenen een vaste gastrol te hebben gespeeld, werd Rajskub een hoofdrolspeelster in het vijfde seizoen van de serie. Tegen het einde van de serie was ze de vrouwelijke hoofdrolspeelster, met de tweede plaats na Kiefer Sutherland. Haar personage had ook de eer om de laatste woorden van de serie te spreken in de finale van seizoen 8. Rajskub en Sutherland verschenen kort als hun 24 personages in een 2007 aflevering, “24 Minutes”, van de Fox animatieserie The Simpsons. In augustus 2013 werd aangekondigd dat ze haar rol van Chloe O’Brian zou hernemen in de 2014 limited serie 24: Live Another Day.
Rajskub was een van de oorspronkelijke castleden van Mr. Show. Ze verscheen in Kelsey Grammer’s The Sketch Show op Fox Television, The King of Queens als een personage genaamd Priscilla, en in tal van films waaronder Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, muziekvideo’s voor Beck, Weezer en Sheryl Crow, alsmede het portretteren van een blinde vrouw in de film Road Trip.
Rajskub maakte deel uit van een komisch duo (met Karen Kilgariff) genaamd Girls Guitar Club. In 2006 speelde ze een cameo in “Partings”, de finale van het zesde seizoen van Gilmore Girls, waarin ze een trobairitz speelde die op zoek was naar haar grote doorbraak. (Rajskub was eerder op Gilmore Girls verschenen als de vrouwelijke hoofdrol in A Film by Kirk, een korte film gemaakt door het personage Kirk Gleason). Ze heeft als actrice meegewerkt aan het Young Storytellers Program. Ze heeft een achtergrond als schilder en ging naar het San Francisco Art Institute.
Rajskub is twee keer genomineerd voor een Screen Actors Guild Award; een keer in 2005, en opnieuw in 2007 voor Outstanding Performance by an Ensemble in a Drama Series. Ze speelde een gastrol in de aflevering “Prime Minister” van Flight of the Conchords als Karen, een fanatieke Art Garfunkel. Ze speelde een gastrol als “Gail the Snail” in een aflevering van It’s Always Sunny in Philadelphia getiteld “The Gang Gives Frank an Intervention”, en speelde de rol opnieuw in de finale van het negende seizoen, “The Gang Squashes Their Beefs,” en seizoen dertien “The Gang Beats Boggs: Ladies Reboot.” In 2009 was ze ook te zien in de film Julie & Julia als Sarah, een van de goede vriendinnen van Julie Powell. In 2010 trad Rajskub op als stand-up in John Oliver’s New York Stand Up Show. In juni 2010 was ze te zien in de aflevering “Lovesick” tijdens het tweede seizoen van de Amerikaanse serie Royal Pains.
Van juli tot en met oktober 2010 trad ze op met haar solovoorstelling, Mary Lynn Spreads Her Legs, in het Steve Allen Theater in Los Angeles. Recensent F. Kathleen Foley van de Los Angeles Times schreef “die vrolijk vulgaire titel vat de algemene toon samen, die vaak luchtig obsceen is”. De show, geschreven door Rajskub met hulp van regisseur/ontwikkelaar Amit Itelman, werd geïnspireerd door Rajskub’s ervaringen met zwangerschap, bevalling, en het vroege moederschap.
In januari 2011 speelde Rajskub een gastrol in de aflevering “Our Children, Ourselves” in het tweede seizoen van ABC’s Modern Family. In de herfst van 2011, verscheen Rajskub in de kortstondige sitcom How to Be a Gentleman. Ook in 2011 begon Rajskub’s webserie, Dicki, uit te zenden op My Damn Channel. Dicki is gebaseerd op een aantal mensen die Rajskub opgroeide in en rond Michigan. Het titelpersonage is een 40-jarige vrouw die thuis bij haar ouders woont, knutselt en haar kunst serieus neemt. Dicki is een van de meest succesvolle webseries van My Damn Channel tot nu toe. Het eerste seizoen werd afgesloten in november 2011, maar een tweede seizoen is momenteel in ontwikkeling. Rajskub trad op in de juni 2012 editie van Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), een maandelijkse showcase waarin beroemdheden waargebeurde verhalen delen die ze nooit aan hun moeder zouden willen vertellen. Momenteel is ze gastvrouw van een podcast op het Nerdist Network genaamd Kickin’ it Mary Lynn Style.
In 2013 verscheen Rajskub in het vierde seizoen van Arrested Development in een stille maar goed ontvangen rol als Heartfire, een personage waarvan Rajskub heeft gezegd “spreek vanuit het hart, maar gebruik geen woorden.” In hetzelfde jaar verscheen Rajskub ook in de webserie All Growz Up met Melinda Hill.
Rajskub verscheen op 27 maart 2015 op Ken Reid’s TV Guidance Counselor podcast.
In augustus 2016 verscheen Rajskub op het Edinburgh Festival Fringe in 24 Hours With Mary Lynn Rajskub en het werd goed ontvangen door fans en critici.
In 2017 verscheen Rajskub in het eerste seizoen van de Adult Swim-serie Dream Corp LLC, waarin ze Patiënt 46 speelde in de aflevering “Are You Down With OCD?”.
In 2018 verscheen Rajskub in Night School tegenover Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe, en Keith David.
In 2021 bracht Rajskub een 49 minuten durende comedyspecial uit genaamd Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; het kan worden gehuurd of gekocht via verschillende video-on-demand diensten.