Geen up-regulation van CAP1, maar verhoogde S308/S310 fosforylering, werd gedetecteerd in pancreaskankercellen
CAP1 eiwitniveaus werden bepaald in Western blotting in een panel van veelgebruikte pancreaskanker cellijnen {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 en Mia PaCa-229}, en vergeleken met die in de geïmmortaliseerde maar niet getransformeerde pancreas cellijn hTERT-HPNE30, die als controle dient. Zoals getoond in Fig. 1A, drukken alle vier kanker cellijnen overvloedige niveaus van CAP1 uit, die vergelijkbaar is met die in HeLa cellen, waarvan we eerder rapporteerden dat ze overvloedige niveaus van zowel CAP1 als CAP212 tot expressie brengen. Wij vonden dat de niet-getransformeerde hTERT-HPNE cellen vergelijkbare niveaus van CAP1 tot expressie brachten als die in de kanker cellijnen. We onderzochten ook de expressieniveaus van de andere CAP-isovorm, CAP2, en ontdekten dat de PANC-1- en Mia PaCa-2-cellen een aanzienlijk verhoogde CAP2-expressie hadden vergeleken met die in de hTERT-HPNE-cellen (Fig. 1A).
Een verhoogde S308/S310-fosforylering op CAP1, maar geen opgehoogde CAP1-expressie, werd waargenomen in pancreaskankercellen. (A) Western blot onthult overvloedige expressieniveaus van CAP1 vergelijkbaar met die in de HeLa cellen werden gedetecteerd in alle vier de kanker cellijnen, en de controle pancreas cellen (hTERT-HPNE) hebben een vergelijkbaar CAP1 expressieniveau. De CAP2-blotresultaten laten zien dat de PANC-1- en Mia PaCa-2-kankercellen overvloedige CAP2-niveaus tot expressie brengen die opmerkelijk hoger waren dan die in de controle hTERT-HPNE-cellen. (B) Western blot onthult verhoogde S308/S310 fosforylering op CAP1 in de PANC-1 en CFPAC-1 pancreaskankercellen in vergelijking met die in de niet-getransformeerde hTERT-HPNE pancreascellen. Het fosfor-specifieke antilichaam herkent fosforsignalen op beide residuen. De uitgelijnde sequenties op de top tonen de sequenties die de tandem fosfor-regulerende site omringen. De serine residuen (S307 & S309 op muis CAP1; S308 & S310 op menselijke CAP1) in de tandem site zijn vet en cursief gemarkeerd (ook onderstreept). De fosforsignalen werden gekwantificeerd met behulp van densitometrie, en de resultaten van drie experimenten werden geanalyseerd met Student’s t-test en uitgezet in de grafiek waarbij de foutbalkjes staan voor S.E.M. “*” geeft aan P < 0.05 en “**” geeft aan P < 0.01. (C) Behandeling van cellen met de GSK3 remmer 6-BIO gedurende 16 uur verminderde opmerkelijk de CAP1 fosforylering in zowel de PANC-1 pancreaskankercellen als de hTERT-HPNE cellen, op een dosis-afhankelijke manier. 6-BIO verminderde ook CAP1 fosforylering in CFPAC-1 cellen op vergelijkbare wijze (niet getoond). GAPDH dient als controle bij Western blotting.
Wij hebben eerder gerapporteerd dat GSK3 S309 op muis CAP124 fosforyleert (equivalent aan S310 op menselijk CAP1; uitgelijnde sequenties getoond in Fig. 1B). Gezien de gerapporteerde hyper-activatie van GSK3 in pancreaskanker25, onderzochten we de mogelijke verhoging van S308/S310 fosforylering op CAP1 in kankercellen, met behulp van een fosfor-specifiek antilichaam dat fosforsignalen herkent op beide serineresten in Western blotting24. Interessant was dat S308/310 fosforylering significant verhoogd was in de kankercellen vergeleken met die in controle cellen (Fig. 1B, getoond met gekwantificeerde gegevens voor PANC-1 en CFPAC-1 cellijnen alleen, maar vergelijkbare resultaten werden verkregen met AsPC-1 en Mia PaCa-2 cellen). Vervolgens remden we GSK3 door kankercellen te behandelen met een krachtige GSK3 remmer 6-BIO (6-broomindirubine-3′-oxime)31 en ontdekten dat de behandeling S308/S310 fosforylering op CAP1 in PANC-1 en CFPAC-1 cellen verminderde, op een dosis-afhankelijke manier (Fig. 1C, alleen getoond voor PANC-1 cellen). Behandeling met 6-BIO verminderde ook de CAP1 fosforylering in de controle pancreascellen. Dienovereenkomstig verminderde een meer selectieve GSK3 remmer, LiCl32, ook CAP1 fosforylering in PANC-1 en AsPC-1 cellen, zoals later getoond. Deze resultaten ondersteunen dat GSK3 ook deel uitmaakt van de fosforyleringsmachine voor CAP1 op S308/S310 in pancreaskankercellen. Er wordt ook opgemerkt dat behandeling van kankercellen en controle cellen met 6-BIO consistent leidde tot merkbare up-regulatie van CAP1, via een onbekend mechanisme.
Knockdown van CAP1 leidde tot verhoogde stress vezels evenals verminderde beweeglijkheid en invasie van kankercellen
We probeerden vervolgens CAP1 het zwijgen op te leggen om de rol van CAP1 in pancreaskankercellen te bepalen. De stabiele knockdown paradigma dat we eerder hebben ontwikkeld is compatibel met een reddingsstrategie, die verificatie van de specificiteit van afgeleide fenotypen van uitputting van CAP112,18,24 mogelijk maakt. Met behulp van twee shRNA constructen S2 en S3 die zich richten op onafhankelijke nucleotide sequenties en effectief CAP1 uitgeschakeld in HeLa en borstkankercellen 12,18,24,33, waren we in staat om stabiele klonen te genereren met efficiënte CAP1 knockdown in de PANC-1 en AsPC-1 cellen, zoals bevestigd in Western blotting (Fig. 2A). Twee stabiele knockdown klonen, elk afgeleid van PANC-1 (S2-1 en S3-3) en AsPC-1 (S2-3 en S2-7), werden respectievelijk door neomycine selectie tot stand gebracht. Met name pogingen om CAP1 in CFPAC-1 en Mia PaCa-2 kanker cellijnen tot zwijgen te brengen, waren echter niet succesvol. De CFPAC-1 cellen faalden om kolonies te vormen na antibiotische selectie, terwijl geen van de ongeveer twee dozijn gescreende stabiele kolonies een substantiële vermindering van CAP1 expressie in Mia PaCa-2 cellen vertoonde (gegevens niet weergegeven).
Knockdown van CAP1 in kankercellen leidde tot verbeterde actine stressvezels, en verminderde celmotiliteit en invasie. (A) Efficiënte CAP1 knockdown in twee stabiele klonen elk voor zowel PANC-1 en AsPC-1 cellen zoals bevestigd in Western blotting. CAP1 werd gedetecteerd in Western blotting, waarbij GAPDH werd gebruikt als een laadcontrole. (B) Depletie van CAP1 in PANC-1 cellen leidde tot verhoogde actine stress vezels. In controle cellen die de lege vector voor de shRNA (Vec) herbergen, waren er zeer beperkte actine stress vezels (aangegeven met pijlen). In tegenstelling, in de CAP1-knockdown cellen (S2-1 en S3-3), actine stress vezels werden versterkt (aangegeven met pijlen) zoals waargenomen in fluorescente microscopie na Phalloidin kleuring. (C) Depletie van CAP1 verminderde de beweeglijkheid in zowel PANC-1 en AsPC-1 cellen zoals gedetecteerd in de wondgenezing en Transwell migratie assays (alleen voor PANC-1). Voor Transwell migratie assays, ~ 2 × 104 cellen serum ’s nachts verdoofd werden geladen op elk inzetstuk geplaatst in een putje geladen met medium met serum. Na 16 uur, gemigreerde cellen werden gescoord en gegevens van drie onafhankelijke experimenten werden verzameld, geanalyseerd met behulp van Student’s t-test, en uitgezet in de grafiek waar foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. “*” geeft P < 0,05 in vergelijking met die in de controle cellen harboring een lege vector (Vec). (D) Depletie van CAP1 verminderde Matrigel invasie in PANC-1 cellen. De assays en gegevensverzameling en analyses werden op dezelfde wijze uitgevoerd als die in de Transwell-migratieassays, behalve dat de insteekmembranen vooraf met Matrigel waren gecoat. “*” geeft P < 0,05 in vergelijking met die van de controle cellen. (E) Verminderde EMT in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen, zoals aangegeven door verhoogde E-Cadherine expressie en verminderde Vimentine expressie niveaus in de CAP1-knockdown stabiele klonen. GAPDH dient als laadcontrole in Western blots.
We onderzochten eerst morfologische en actine-cytoskeletale veranderingen in de CAP1-knockdown PANC-1 en AsPC-1 cellen. In tegenstelling tot de toegenomen celgrootte in de CAP1-knockdown HeLa en uitgezaaide borstkankercellen12,18,24, veroorzaakte depletie van CAP1 geen merkbare toename in de grootte van PANC-1 of AsPC-1 cellen. Vervolgens kleurden we het actine cytoskelet in de PANC-1 cellen met Phalloidin, gevolgd door fluorescentiemicroscopie. PANC-1 cellen (en pancreaskankercellen in het algemeen) blijken slecht georganiseerde actine cytoskelet structuren te hebben, vooral in termen van de stress vezels (Fig. 2B), in verhouding tot de cellijnen die gewoonlijk gebruikt worden voor actine cytoskelet studies, zoals HeLa en NIH3T3 fibroblasten12,24. Niettemin, verbeterde stress vezels waren duidelijk in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen in vergelijking met die in de controle cellen (Fig. 2B). Alle 26 onderzochte controlecellen met een lege vector vertoonden een zeer beperkte aanwezigheid van stressvezels. Daarentegen hadden 20 van de 27 (74,1%) van de S2-1 en 18 van de 23 (78,3%) van de S3-3 onderzochte CAP1-knockdown cellen opmerkelijk verhoogde stress vezels, vergelijkbaar met die getoond in Fig. 2B. Accumulatie van stress vezels is consequent waargenomen in andere cellen met CAP1 uitputting 12,13, een fenotype dat wordt verondersteld te zijn afgeleid van het verlies van zowel CAP1 functies in sequestrerende actine monomeren en in het bevorderen van actine filament turnover.
Consistent met de verbeterde stress vezels, uitputting van CAP1 is gemeld om de beweeglijkheid te verminderen in een aantal zoogdier celtypes, waaronder kankercellen 13,14,17,18,19. Tijdelijke uitschakeling van CAP1 in pancreaskankercellen bleek ook de beweeglijkheid van de cellen te verminderen in wondgenezingstests14. We hebben het effect van stabiele CAP1 knockdown op de invasiviteit van pancreaskankercellen getest door wondgenezingstests, Transwell-migratietests en Matrigel-invasietests uit te voeren. Depletie van CAP1 verminderde de beweeglijkheid van de cellen aanzienlijk in de wondgenezingstests voor zowel PANC-1 als AsPC-1 cellen (Fig. 2C), wat consistent is met de eerder gerapporteerde resultaten14. De wonden in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen (zowel S3-3 als S2-1) genazen slechts marginaal 24 uur na het inbrengen, terwijl in de controle cellen de opening bijna volledig gevuld was. Vergelijkbare effecten werden waargenomen in de stabiele CAP1-knockdown AsPC-1 klonen S2-3 en S2-7 (Fig. 2C). De resultaten van de Transwell-migratieproeven van PANC-1 cellen waren consistent met die van de wondgenezingstests, zoals blijkt uit de grafiek van gekwantificeerde resultaten in het onderste paneel (Fig. 2C). Bovendien onthullen de invasieproeven dat uitputting van CAP1 ook het vermogen van PANC-1 kankercellen verminderde om door Matrigel te penetreren en binnen te dringen (Fig. 2D). Student’s t-test analyses van gegevens verzameld van drie onafhankelijke assays onthullen aanzienlijk verminderde invasie in de CAP1-knockdown PANC-1 stabiele cellen (Fig. 2D). Tenslotte, aangezien EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) gerelateerd is aan de invasiviteit van kankercellen, testten we het mogelijke effect van CAP1-knockdown op EMT. Inderdaad, de CAP1-knockdown PANC-1 cellen hadden een verhoogde E-Cadherine, wat wijst op een verminderde EMT (Fig. 2E). We testten ook een andere EMT marker, Vimentine, en ontdekten dat de uitputting van CAP1 de expressie ervan verminderde (Fig. 2E). Samen ondersteunen deze resultaten een vereiste rol voor CAP1 in de invasiviteit en EMT in de PANC-1 kankercellen.
Remming van GSK3, die CAP1 fosforylering onderdrukt, verminderde de beweeglijkheid en invasie van kankercellen
Onze eerdere bevindingen suggereren dat voorbijgaande fosforylering cruciaal is voor de CAP1 functie in het reguleren van het actine-cytoskelet24. De verhoogde CAP1 fosforylering in pancreaskankercellen, consistent met de geactiveerde GSK3, suggereert dat fosfor-regulatie ook een rol kan spelen voor de CAP1 functie in de invasiviteit van kankercellen. We hebben deze mogelijkheid getest door GSK3 te remmen, wat S308/S310 fosforylering onderdrukt en ondertussen de CAP1 regulatie verstoort door voorbijgaande fosforylering op de regulatieplaats. PANC-1 cellen werden behandeld met 6-BIO gevolgd door celmigratie en invasie testen. Effecten van de verminderde S308/S310 fosforylering op CAP1, door behandeling met 5 μM 6-BIO (Fig. 1C), werden eerst getest. Zoals getoond in Fig. 3A, verminderde 6-BIO behandeling significant de beweeglijkheid van PANC-1 cellen in zowel de wondgenezing als de Transwell migratie assays. We bevestigden ook dat behandeling van PANC-1 en AsPC-1 cellen met een andere GSK3 remmer, LiCl, zowel de CAP1 fosforylering als de beweeglijkheid van de cellen in wondhelingsproeven verminderde (Fig. 3A,B). Bovendien verminderde 6-BIO behandeling ook de Matrigel invasie van PANC-1 cellen (Fig. 3C). Tenslotte, omdat bekend is dat GSK3 een breed scala aan celfuncties reguleert via een veelheid aan substraatmoleculen, is het effect van GSK3 remming op celmotiliteit waarschijnlijk een collectieve output via meerdere GSK3 targets die betrokken zijn bij de regulatie van het cytoskelet, celpolarisatie en migratie34,35. We hebben dus getest en vergeleken de effecten van 6-BIO in het verminderen van de cel motiliteit in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen en controle cellen. Zoals te zien in de grafiek in Fig. 3D, verminderde 6-BIO behandeling significant de beweeglijkheid van de controle (Vec) cellen, maar niet die van de CAP1-knockdown (S2-1 en S3-3) cellen in de wondgenezingstesten. Al met al ondersteunen deze resultaten dat fosforregulatie via S308/S310 een belangrijke rol speelt voor CAP1 om de motiliteit en invasie in pancreaskankercellen te bevorderen.
Inhibitie van GSK3, die de CAP1-fosforylering verminderde, bracht ook de motiliteit en invasie van kankercellen in gevaar. (A) Behandeling van PANC-1-cellen met 6-BIO of LiCl verminderde de beweeglijkheid van de cellen in de wondgenezing en Transwell-migratieproeven. Behandeling met 100 mM LiCl verminderde ook effectief de CAP1 fosforylering in PANC-1 cellen. Transwell-migratieproeven met PANC-1 cellen werden op dezelfde wijze uitgevoerd als beschreven in Fig. 2, waarbij NT staat voor cellen zonder 6-BIO behandeling. (B) Behandeling met 100 mM LiCl verminderde ook merkbaar de CAP1-fosforylering in AsPC-1-cellen, evenals de beweeglijkheid van de cellen in de wondgenezingstests. (C) Behandeling van PANC-1-cellen met 5 μM 6-BIO verminderde de invasie van kankercellen in matrigelinvasietests aanzienlijk. Matrigel invasie assays, met inbegrip van het verzamelen van gegevens en analyses, werden op dezelfde wijze uitgevoerd als beschreven in Fig. 2D. (D) Knockdown van CAP1 in PANC-1 cellen compromitteerde het effect van 6-BIO in het verminderen van celmotiliteit in wondgenezing assays. Controle en CAP1-knockdown stabiele PANC-1 klonen werden gekweekt gedurende 16 uur na de invoering van de wond, en de stippellijnen geven randen van de initiële kloof. Cel motiliteit werd gekwantificeerd, geanalyseerd met behulp van Student’s t-test, en uitgezet in de grafiek waar error bars vertegenwoordigen standaarddeviatie. “*” geeft P < 0,05 en “**” geeft P < 0,01.
Fosfor mutanten van CAP1 hadden gecompromitteerde functies in het verlichten van de versterkte stress vezels en het bevorderen van de ontwikkeling van lamellipodia in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen
Onze bevindingen van de CAP1-knockdown cellen ondersteunen dat CAP1 nodig is voor de beweeglijkheid en invasie van kankercellen, en resultaten van GSK3 remming suggereren dat S308/S310 fosforylering een sleutelrol speelt in de CAP1 functies. Vervolgens gebruikten we een re-expressiestrategie om deze gevallen verder vast te stellen. Wild type CAP1 (WTCAP1) en de fosfor mutanten die ofwel gefosforyleerd (S307D/S309D; DD) of niet-fosforyleerbare (S307A/S309A; AA) vormen van CAP1 nabootsen, zoals eerder beschreven 12,18,24, werden stabiel geher-expresseerd in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen om hun mogelijkheden te testen in het herstel van de actine cytoskelet en cel morfologische fenotypes. Deze mutanten hebben mismatches met de S3 shRNA doelsequentie om herkenning van de afgeleide mRNA’s door de shRNA stabiel aanwezig in de knockdown cellen te voorkomen, maar zonder wijziging van een aminozuur op CAP112. We waren in staat om stabiele klonen die WT muis CAP1, of de AA en DD fosfor mutant opnieuw uit te drukken, zoals bevestigd in Western blotting tegen de 6xHis tag (Fig. 4A) vast te stellen. Merk op dat twee irrelevante banen waren verwijderd uit de oorspronkelijke Western blot afbeelding (monsters in die twee banen werden gebruikt om de re-expressie van twee serine 36 fosfor mutanten op de N-terminus te bevestigen). De gehele set van de oorspronkelijke Western blot resultaat wordt getoond in supplementaire Fig. 1. De morfologie van de cellen die de AA (AA-R) of DD (DD-R) mutant weer tot expressie brengen, werd onderzocht met fasemicroscopie en vergeleken met die van de cellen die WTCAP1 (WT-R) weer tot expressie brengen. Het is gemeld dat knockdown van CAP1 in sommige zoogdier celtypes, waaronder HeLa en uitgezaaide borstkankercellen, leidde tot significant toegenomen celgrootte 12,13,18, een fenotype we eerder bevestigd specifiek te zijn voor knockdown van CAP112,18. CAP1-knockdown in PANC-1 cellen of AsPC-1 cellen, echter, toonde dat effect niet. Integendeel, stabiele re-expressie van WTCAP1 of de fosfor mutanten in de knockdown cellen deed de celgrootte juist significant toenemen (Fig. 4B). Bovendien leidde re-expressie van WTCAP1 tot de ontwikkeling van robuuste lamellipodia (aangegeven met pijlen), een subcellulaire structuur die rijk is aan filamenteuze actine en van cruciaal belang is voor de directionele celbeweging (Fig. 4C), terwijl vrijwel geen van de knockdown cellen met een lege controle vector dergelijke lamellipodia ontwikkelde. Re-expressed AA of DD mutant ook gestimuleerd de vorming van lamellipodia tot op zekere hoogte, maar hun maten waren merkbaar kleiner in vergelijking met die in de cellen re-expressing WTCAP1 (aangegeven met pijlen in Fig. 4C). We telden 200 cellen voor elk celtype, en de percentages cellen die lamellipodia van grote afmetingen herbergden waren: 0% (0/200) voor de knockdown cellen (Vec), 14,5% (29/200) voor de WT-R cellen, en 9% (18/200) en 7,5% (15/200), respectievelijk, voor de AA-R en DD-R cellen.
Effecten van re-expressie van WTCAP1 en de fosfor-mutanten in de CAP1-knockdown PANC-1-cellen op het actine-cytoskelet, de celgrootte en de lamellipodia-ontwikkeling. (A) Bevestiging van re-expressie van WTCAP1 en de AA en DD fosfor mutanten in de S3-3 CAP1-knockdown PANC-1 stabiele cellen in Western blotting met behulp van het antilichaam tegen de 6xHis tag. Twee irrelevante rijstroken waren verwijderd uit de oorspronkelijke Western blot beeld (getoond in Supplementary Fig. 1); (B) gekwantificeerde gegevens tonen significant toegenomen celgrootte in cellen opnieuw uitdrukken van WTCAP1 of de fosfor mutanten in de CAP1-knockdown cellen. Maten van 50 cellen per veld werden gemeten met behulp van het Image-J programma. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van Student’s t-test, en uitgezet in de grafiek waar de foutbalken geven de standaardafwijking. “*” geeft P < 0,05 in vergelijking met de controle cellen harboring de lege vector (Vec-R). (C) Fasebeelden tonen aan dat re-expressie van WTCAP1 of de fosfor mutanten de vorming van lamellipodia stimuleerde. Sommige cellen die WTCAP1 (WT-R) opnieuw tot expressie brengen, ontwikkelen lamellipodiën van zeer grote afmetingen (aangegeven met pijlen). Re-expressie van de AA (AA-R) of DD (DD-R) mutant simuleerde ook de vorming van lamellipodia, maar hun grootte is merkbaar kleiner in vergelijking met die in de cellen die WTCAP1 re-expresseren. Geen dergelijke lamellipodia werden waargenomen in de controle CAP1-knockdown cellen harboring de lege vector (Vec-R). (D) Re-expressie van WTCAP1 in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen verminderde stress vezels, terwijl de cellen met re-expressie van de mutanten verhoogde stress vezels hadden. De cellen die de fosfor-gemimeteerde DD mutant heruitdrukten hadden de meest verhoogde stress vezels. De pijlen geven de stressvezels aan, of het ontbreken ervan in het geval van de WT-R cellen.
We hebben vervolgens gekeken naar de mogelijkheden van de fosformutanten om de versterkte stressvezels in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen te verlichten. Zoals blijkt uit de confocale beelden in Fig. 4D, verminderde re-expressie van WTCAP1 (WT-R) effectief de versterkte stressvezels, waardoor het fenotype werd hersteld, en de stressvezels werden opgelost in grote gebieden aangegeven met een pijl. Daarentegen waren de fosfor mutanten minder effectief in het verlichten van de versterkte stress vezels. Cellen die de AA-mutant weer tot expressie brengen, vertonen iets meer stressvezels dan de cellen die met WTCAP1 zijn gered, terwijl de cellen die de DD-mutant weer tot expressie brengen, nog meer verhoogde stressvezels blijken te hebben. Deze resultaten zijn consistent met onze eerdere bevindingen in HeLa cellen, die suggereren dat gefosforyleerd CAP1 de ‘actieve’ vorm is ten opzichte van gefosforyleerd CAP124, terwijl voorbijgaande fosforylering noodzakelijk wordt geacht voor optimale cellulaire functies van CAP1. Deze resultaten suggereren ook dat voorbijgaande S308/S310 fosforylering belangrijk is voor CAP1 om het actine cytoskelet in pancreaskankercellen te reguleren; verstoring van de regulering door voorbijgaande fosforylering leidt tot defecten in de CAP1 functie bij het bevorderen van actine filament turnover.
CAP1 fosfor mutanten hadden defecten die de verminderde invasiviteit in de CAP1-knockdown kankercellen redden
Omdat dynamische actine filament turnover de primaire drijvende kracht van celbeweging is, testten we vervolgens hoe goed de fosfor mutanten de verminderde celbeweeglijkheid en invasie in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen redden. We voerden eerst Transwell migratieproeven uit, en vonden dat re-expressie van WTCAP1 de celmotiliteit aanzienlijk verhoogde in vergelijking met de controlecellen die een lege vector herbergen, zoals weergegeven in gekwantificeerde resultaten in de grafiek (Fig. 5A). De geher-expresseerde AA mutant (AA-R), hoewel niet zo effectief als WTCAP1, herstelde gedeeltelijk de verminderde beweeglijkheid van de cellen in de Transwell migratieproeven. De DD-mutant (DD-R) daarentegen redde de verminderde celmotiliteit niet, en de snelheid was vergelijkbaar met die in de CAP1-knockdown-cellen die een lege vector bevatten. Deze resultaten komen overeen met de mogelijkheden tot redding van de verhoogde stress vezels door WTCAP1 en de fosfor mutanten. We testten verder de redding van de verminderde Matrigel invasie in de CAP1-knockdown cellen, zoals te zien is in de gekwantificeerde resultaten in Fig. 5B. Ook WTCAP1 redde de verminderde invasie in de CAP1-ontkoppelde PANC-1 cellen het meest effectief; de AA mutant bereikte een gedeeltelijke redding, terwijl de DD mutant het fenotype letterlijk niet redde. Tenslotte verminderde re-expressie van WTCAP1 in de CAP1-afgesplitste cellen ook de expressie van E-Cadherine (Fig. 5C), wat verder ondersteunt dat CAP1 nodig is voor EMT in PANC-1 kankercellen. Samen ondersteunen deze resultaten dat fosfor-regulatie via de S308/S310 tandem site een belangrijke rol speelt voor CAP1 om de motiliteit en invasie van pancreaskankercellen te bevorderen.
Effecten van WTCAP1 en de fosormutanten bij het opheffen van de verminderde motiliteit en invasie in de CAP1-knockdown PANC-1-cellen. (A) WTCAP1 en de AA-mutant brachten de verminderde beweeglijkheid van CAP1-geknockte PANC-1-cellen in Transwell-migratietests tot rust, terwijl de DD-mutant hier niet in slaagde. De experimenten, gegevensverzameling en analyses werden op dezelfde wijze uitgevoerd als beschreven in Fig. 2. De foutbalkjes vertegenwoordigen S.E.M., en “*” wijst op P < 0,05 in vergelijking met de controlecellen die een lege vector (Vec-R) herbergen. (B) WTCAP1 en de AA mutant herstelden effectief de verminderde Matrigel invasie van de CAP1-knockdown PANC-1 cellen, terwijl de DD mutant dit ook niet deed. De experimenten, gegevensverzameling en analyses werden op dezelfde wijze uitgevoerd als beschreven in Fig. 2. De foutbalkjes geven S.E.M. weer, en “*” wijst op P < 0.05 in vergelijking met de controlecellen. (C) Re-expressie van WTCAP1 herstelde ook de geüpreguleerde E-Cadherine in de CAP1-knockdown PANC-1 cellen.
Aanwijzingen die ondersteunen dat CAP1 extracellulaire groeifactorsignalen medieert om de invasiviteit van kankercellen te controleren
Fysiologische stimuli, zoals de groeifactoren PDGF en HGF (Hepatocyte Growth Factor)36, staan erom bekend dat ze de herschikking van het actine-cytoskelet en celmigratie stimuleren. Aangezien fosforregulatie op S308/S310 cruciaal is voor CAP1 functies in het reguleren van het actine cytoskelet en de invasiviteit van kankercellen, onderzochten we de mogelijkheid dat deze stimuli CAP1 fosforylering kunnen reguleren, en hierdoor de actine cytoskelet herschikking en de invasiviteit van kankercellen te controleren. Interessant is dat behandeling van serum-gesterfde PANC-1 en AsPC-1 cellen met PDGF de S308/S310 fosforylering op CAP1 verminderde, het meest opmerkelijk op het 5-minuten tijdstip (Fig. 6A,B). Behandeling van pancreaskankercellen met HGF of serum had geen aanzienlijk effect in het induceren van de defosforylering van CAP1 (Supplementary Fig. 2; getoond voor PANC-1 cellen). Daarom is signalering via CAP1 waarschijnlijk tenminste gedeeltelijk verantwoordelijk voor PDGF om actine cytoskeletale reorganisatie en kankercel invasiviteit te stimuleren. Deze resultaten zijn ook consistent met de opvatting dat gefosforyleerd CAP1 de ‘actieve’ vorm is, zoals gesuggereerd door meerdere lijnen van bewijs, waaronder cofiline binding, subcellulaire lokalisatie van de fosfor mutanten, en verhoogde fosforylering van CAP1 in cellen gekweekt in suspensie24. Echter, tijdelijke fosforylering op de tandem-regulerende plaats, namelijk de cyclus tussen gefosforyleerde en gedefosforyleerde vormen, wordt verondersteld vereist te zijn voor optimale cellulaire functies van CAP124. De CAP1-defosforyleringssignalen werken waarschijnlijk samen met de CAP1-fosforyleringssignalen om de CAP1-celfuncties te reguleren door de transiënte fosforylering op S308/S310 aan te sturen.
PDGF induceerde defosforylering van CAP1 in pancreaskankercellen. (A) Behandeling van serumarme AsPC-1 kankercellen met PDGF induceerde CAP1-defosforylering op S308/S310. De cellen werden ’s nachts gekweekt, 24 uur in een serumloze toestand gehouden, gevolgd door behandeling met 30 ng/ml PDGF gedurende de aangegeven tijdsduur. Cellysaten werden bereid en gebruikt in de Western blotting met een fosfor-specifiek antilichaam dat fosforsignalen detecteert op beide residuen van de tandem regulerende site op CAP1. Het defosforyleringseffect was het meest significant bij het 5 minuten durende PDGF-behandelingsmoment. (B) Behandeling van serumarme PANC-1 cellen met PDGF induceerde ook opmerkelijke CAP1 defosforylering, op vergelijkbare wijze als bij AsPC-1 cellen. Behandeling van cellen en Western blotting werden uitgevoerd volgens dezelfde procedures als gebruikt voor AsPC-1 cellen. GAPDH diende als laadcontrole in Western blot.
Depletie van CAP1 in pancreaskankercellen verminderde FAK-activiteit, maar veroorzaakte geen veranderingen in ERK of celproliferatie
Wij hebben onlangs een nieuwe rol voor CAP1 geïdentificeerd in het reguleren van de proliferatie van borstkankercellen, waarbij depletie van CAP1 celcontext-afhankelijke effecten op de proliferatie uitoefent, vergezeld van consistente veranderingen in ERK-activiteit18. Wij hebben getest of CAP1 ook ERK en proliferatie in pancreaskankercellen kan reguleren. Er werden geen significante veranderingen in de expressie of fosforylering van ERK waargenomen in de CAP1-knockdown PANC-1 stabiele klonen, vergeleken met die in de controle cellen (Supplementary Fig. 3A). We voerden ook MTT-tests uit om de proliferatie van de S2-1 en S3-3 stabiele knockdown cellen te testen en ze te vergelijken met die van de controle (Vec) cellen, en ontdekten licht verminderde percentages van celproliferatie in de knockdown cellen (Supplementaire Fig. 3B). De verschillen waren echter statisch niet significant, met de P-waarden die de O.D. (bij 570 nm) vergelijken tussen S2-1 cellen en controle cellen op 0.219, en die tussen S3-3 cellen en controle cellen op 0.223. Deze resultaten wijzen erop dat CAP1 geen significante rol speelt in het reguleren van de proliferatie in pancreaskankercellen. Bovendien, gezien de algemene tendens dat stabiele knockdown paradigma gevoelig is voor kloonvariaties, genereerden we pools van CAP1 stabiele knockdown PANC-1 cellen, waarvan wordt aangenomen dat ze de effecten van CAP1 depletie op ERK nauwkeuriger weerspiegelen, door het vermijden van potentiële invloed van selectie bias. Zoals aangetoond in Fig. 7A, werden pools van PANC-1 stabiele cellen met efficiënte CAP1 knockdown, afgeleid van zowel de S2 en S3 shRNA constructen, vastgesteld na neomycine selectie, zoals bevestigd in Western blotting. In overeenstemming met de bevindingen van het gebruik van stabiele knockdown klonen, werden geen opmerkelijke veranderingen in ERK expressie of de fosforylering ervan gedetecteerd in de knockdown poolcellen in vergelijking met de controle poolcellen.
CAP1-knockdown PANC-1 poolcellen hadden verminderde FAK activiteit en celadhesie, maar geen veranderingen in ERK. (A) CAP1-knockdown PANC-1 poolcellen, afkomstig van zowel S2 als S3 shRNA constructen, vertoonden geen veranderde ERK expressie of activiteit in vergelijking met de controle poolcellen die een lege vector bevatten, zoals gedetecteerd in Western blotting. ERK activiteit werd gedetecteerd in Western blotting met behulp van een fosfor-specifiek antilichaam tegen de Thr202/Tyr204 sites. GAPDH diende als laadcontrole. (B) Verminderde FAK-activiteit werd gedetecteerd in de CAP1-knockdown PANC-1 poolcellen in vergelijking met de controle poolcellen. FAK activiteit werd beoordeeld door fosforylering bij Tyr397, met behulp van een fosfor-specifiek antilichaam tegen de site in Western blotting; (C) CAP1-knockdown pool cellen hadden verminderde celadhesie op de geteste tijdstippen (45 minuten en 2 uur) na het uitplaten van cellen op fibronectine-gecoate platen. Ongeveer 2 × 104 cellen werden uitgezet op elk putje van een 6-well plaat, en cellen niet gehecht op de aangegeven tijdstippen werden afgewassen. Het aantal aangehechte cellen werd geteld in vijf willekeurige velden onder een fasemicroscoop en er werden beelden genomen. (D) De gegevens van drie onafhankelijke celadhesietests werden geanalyseerd met behulp van de Student’s t-test en uitgezet op de grafiek waarbij de foutbalkjes de standaardafwijking weergeven. “**” geeft P < 0,01 in vergelijking met de controle cellen harboring de lege vector.
Knockdown van CAP1 in borstkankercellen veroorzaakt verschillende veranderingen in FAK in de metastatische en niet-metastatische borstkankercellen18. Wij ontdekten ook verminderde FAK activiteit, zonder veranderingen in FAK expressie niveaus, in de CAP1-knockdown PANC-1 poolkankercellen (Fig. 7B). Gebaseerd op deze resultaten, testten we verder de effecten van CAP1 depletie op celadhesie in adhesietests, vergelijkbaar met wat we eerder deden12,18. We vonden dat de CAP1-knockdown pools cellen afgeleid van beide shRNA constructen opmerkelijk verminderde celadhesie in vergelijking met de controle cellen hadden (Fig. 7C). Op beide tijdstippen (45 minuten en 2 uur) nadat de cellen waren uitgezet op fibronectine-gecoate oppervlak, aanzienlijk meer controle cellen bevestigd in vergelijking met de CAP1-knockdown pool cellen. Verder hadden meer van de bijgevoegde controle cellen ook volledig verspreid (ontwikkelde lamellipodia en cellen niet laten zien zo helder) in vergelijking met de CAP1-knockdown cellen (Fig. 7C). We scoorden de aantallen bijgevoegde cellen van drie velden voor vergelijking, en gegevens van drie onafhankelijke experimenten werden gekwantificeerd zoals uitgezet in de grafiek (Fig. 7D).