Abstract
Macrofagen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de gastheer, naast het krachtige vermogen om pathogenen of vreemde zaken te fagocytoseren. Zij vervullen verschillende rollen in de immuunregulatie, de wondgenezing en het behoud van de weefselhomeostase. Macrofagen worden gekenmerkt door een hoge heterogeniteit, die kunnen polariseren in ten minste twee belangrijke uitersten, macrofagen van het M1-type (klassieke activatie), die normaal afkomstig zijn van monocyten, en macrofagen van het M2-type (alternatieve activatie), die meestal die weefsel-residente macrofagen zijn. Gebaseerd op het wondgenezingsproces in de huid, hebben de vorige studies gedocumenteerd hoe deze verschillende subtypes van macrofagen deelnemen aan weefselherstel en remodellering, terwijl het mechanisme van macrofagen in de darmanastomotische genezing nog niet is vastgesteld. Dit overzicht geeft een samenvatting van het momenteel beschikbare bewijs met betrekking tot de verschillende rollen van gepolariseerde macrofagen in het fysiologische verloop van anastomotische genezing en hun pathologische rol in anastomotische lekkage, de gevaarlijkste complicatie na gastro-intestinale chirurgie.
1. Inleiding
Macrofagen zijn myeloïde immuuncellen die een centrale rol spelen in ontstekingen en in de verdediging van de gastheer. Deze cellen worden gekenmerkt door een krachtig vermogen tot fagocytose en beschermen de gastheer tegen infecties via een proces dat “aangeboren immuniteit” wordt genoemd. In de afgelopen jaren, met de accumulatie van bewijsmateriaal, zijn macrofagen naar voren gekomen als een van de meest veelzijdige cellen. Hun rol is verschoven van immuun effector cellen die de verdediging van de gastheer uitvoeren als “vuilnismannen” naar overheersende “regisseurs” en “uitvoerders” voor het reguleren van de ontstekingsreactie, het handhaven van weefselhomeostase, deelnemen aan wondgenezing en weefselremodellering.
Macrofagen zijn actief betrokken bij het wondgenezingsproces, terwijl hun rol in een speciale chirurgische wond, ook wel bekend als de anastomotische wond, nog niet volledig is vastgesteld. Anastomosen worden aangelegd na verwijdering van een gastro-intestinale tumor of darmresectie door chirurgen om de voortzetting van het maagdarmkanaal te reconstrueren. Abnormale genezing van anastomose kan zich ontwikkelen tot anastomotische lekkage (AL), gedefinieerd als luminale inhoud die lekt uit een chirurgische darmaansluiting. Het is de gevaarlijkste complicatie na colorectale chirurgie , omdat het verantwoordelijk is voor maximaal 40% postoperatieve mortaliteit, langdurige ziekenhuisopname, en een stijging van de kosten van de gezondheidszorg als gevolg van de behandeling van sepsis en de noodzaak van heroperatie .
Vanuit een macroscopisch oogpunt, de oorzaak van AL omvat voornamelijk communicatie, infectie, en genezing verstoringen . Een gedetailleerd mechanisme op cellulair niveau is echter nog niet vastgesteld vanwege het beperkte bewijsmateriaal. In dit overzicht, gebaseerd op heterogene populaties van macrofagen en hun tegengestelde neigingen tot polarisatie, bespreken we de rol van verschillende types macrofagen in een ongestoorde anastomotische genezing en hun pathologische rol in anastomotische lekkage.
1.1. Subtypes van Macrofagen
Macrofagen of mononucleaire fagocyten werden lang verondersteld afkomstig te zijn van hematopoietische stamcellen (HSCs). Het heersende dogma stelde dat alle macrofagen voortkwamen uit en ook werden aangevuld door monocyten . De cellen van de macrofagenfamilie (cellen van het mononucleaire fagocytensysteem) vertonen echter een opmerkelijke heterogeniteit, zowel wat hun morfologie als wat hun biologische functies betreft. Deze recente gegevens hebben de lang gekoesterde opvatting over “HSC-monocyt-macrofaag” in twijfel getrokken. Er is aangetoond dat weefsel-residente macrofagen zoals Kupffercellen van de lever, epidermale Langerhanscellen van de huid, en microglia van de hersenen afkomstig zijn van een dooierzak en kunnen persisteren in volwassen muizen onafhankelijk van HSC’s . Deze weefsel-residente macrofagen kunnen zich in situ vernieuwen, hoewel zij in bepaalde situaties ook door bloedmonocyten zouden kunnen worden aangevuld. In tegenstelling tot monocyt-afgeleide macrofagen die deelnemen aan een antibacterieel proces tijdens een acute ontstekingsreactie, uiten weefsel-residente macrofagen verschillende functionele eigenschappen en spelen een centrale rol in het behoud van weefselarchitectuur, functie en homeostase , en hun rol in anastomotische genezing wordt hieronder verder besproken.
De diversiteit en plasticiteit werden erkend als kenmerken van macrofagen, die bijdragen tot hun aanzienlijke heterogeniteit. In het algemeen kan de polarisatie van macrofagen worden verdeeld in twee grote uitersten, namelijk de klassieke activering die resulteert in M1-type macrofagen (M1) en de alternatieve activering die resulteert in M2-type macrofagen (M2). Deze twee typen macrofagen vertonen verschillende functionele fenotypen als reactie op microënvironmentele signalen, zoals microbiële producten, beschadigde cellen en cytokinen van geactiveerde lymfocyten. Meer bepaald kunnen liganden van Toll-like receptoren (TLR’s) en interferon-γ (IFN-γ) macrofagen induceren om te polariseren in M1-type macrofagen; interleukine-4 (IL-4) en interleukine-13 (IL-13) daarentegen induceren macrofagen om te polariseren in M2-type macrofagen. Een dergelijke verklaring illustreert echter niet volledig alle verschillende activeringsscenario’s. Murray et al. stelden voor dat er een aantal andere subtypes tussen M1 en M2 zouden zijn, waaronder de M2a subgroep geïnduceerd door IL-4 en IL-13, de M2b subgroep geactiveerd door immuuncomplexen (TLR’s), en de M2c subgroep gedeactiveerd door glucocorticoïden, transformerende groeifactor (TGF), of interleukine-10 (IL-10) . Bovendien is ook gemeld dat er een aanvullend subtype van M2 (M2d) zou kunnen zijn, dat wordt opgewekt door TLR-agonisten en adenosine . Het lijkt erop dat de polarisatie van macrofagen moet worden gezien als een doorlopend spectrum, waarin twee typen macrofagen (M1 en M2) de tegenovergestelde uiteinden bezetten. Een andere classificatie van polarisatie voorgesteld door Mosser en Edwards suggereerde dat macrofagen geactiveerd worden om drie populaties te vormen die respectievelijk belast zijn met verdediging van de gastheer, wondgenezing en immuunregulatie. De auteurs deelden macrofagen in op basis van hun fundamentele functies en niet op basis van de stimuli. Passend bij de eerder besproken opvatting van het “M1-M2” paradigma, zijn de meeste van monocyt-afgeleide macrofagen klassiek geactiveerd en drukken het M1 fenotype uit, dat de verdediging van de gastheer uitoefent; omgekeerd worden weefsel-residente macrofagen voornamelijk geactiveerd in het alternatieve pad dat M2-achtige karakteristieken uitdrukt en de weefselhomeostase en het oplossen van ontstekingen in stand houdt. The Role of Polarized Macrophages in Physiological Anastomotic Healing
De wand van het spijsverteringskanaal bevat vier lagen (d.w.z., mucosa, submucosa, muscularis propria, en serosa). Voor een klassieke end-to-end omgekeerde darm anastomosis, appositie van de serosa verdwijnt de kloof tussen de twee uiteinden van het maagdarmkanaal, en levert een barrière die de steriele buikholte isoleert van de luminale inhoud en bacteriën; bovendien is deze laag belangrijk in het leveren van een matrix voor fibroblasten . De submucosa bestaat uit bloedvaten, lymfevaten en zenuwvezels; deze laag is de bron van fibroblasten die actief worden na gastro-intestinale chirurgie en collageen beginnen af te zetten. De geniete of gehechte collageenvezels in deze laag leveren het grootste deel van de treksterkte van de anastomose; vandaar dat de submucosa van groot belang is voor de genezing van de anastomose. De slijmvlieslaag speelt ook een rol bij het handhaven van de homeostase om het genezingsproces mogelijk te maken. Een pool van macrofagen in de gastro-intestinale mucosa is de grootste pool van weefselmacrofagen in het lichaam, en een langdurige afwezigheid of disfunctie van macrofagen belemmert de anastomotische genezing .
Weefselherstel en genezing na verwonding zijn eeuwenlang bestudeerd, maar blijven begrepen tot een beperkt object, dat wil zeggen, de huid. Anders dan dat, genezing van het maagdarmkanaal is anatomisch verborgen voor inspectie, alleen de chirurg in staat stellen om het succes van de operatie te beoordelen alleen op de parameters van de patiënt van het algemeen welzijn . Er zijn enkele verschillen tussen de genezing van huid en anastomose, waaronder anatomie (bv. geen equivalent anatomisch onderdeel van de serosa in huidweefsel) en collageen- en collagenaseactiviteit . De klassieke reactie op verwonding komt echter in alle organen en weefsels voor. Het fysiologische verloop van de genezing van anastomosen kan ook worden onderverdeeld in drie overlappende maar onderscheiden stadia, die ontsteking, nieuwe weefselvorming en remodellering omvatten (figuur 1) .
1.2.1. Ontsteking
Naast infectie van diverse microbiële factoren kunnen ook verwondingen of trauma’s, zoals een chirurgische slag, leiden tot een niet-pathogeen-geassocieerde ontsteking, die verder kan worden onderverdeeld in de vroege ontstekingsreactie en de late ontstekingsreactie . In de vroege ontstekingsfase worden in eerste instantie neutrofielen gerekruteerd vanuit het circulerende bloed naar het lokale wondweefsel (het anastomotische gebied). Deze gerekruteerde polymorfonucleaire cellen verwijderen de lokale vreemde deeltjes of bacteriën en ondergaan vervolgens apoptose of necrose. Daarna worden monocyten gerekruteerd en differentiëren zij zich in macrofagen, die zeer fagocytisch zijn. Zij fagocyteren aangetaste neutrofielen en andere weefselresten om verdere weefselschade te voorkomen. Tijdens deze fase, als reactie op pathogeen-geassocieerde modificerende patronen (PAMP’s) in een besmettelijke omstandigheid of schade-geassocieerde modificerende patronen (DAMP’s) in een steriele omstandigheid, worden macrofagen klassiek geactiveerd en brengen zij het M1 fenotype tot expressie. M1 macrofagen geven hoge concentraties ontstekingsbevorderende cytokines af, zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-1β (IL-1β), interleukine-6 (IL-6) en interleukine-12 (IL-12), protease en reactieve zuurstofspecies (ROS), die alle belangrijk zouden zijn voor het doden van micro-organismen en een ontstekingsbevorderende reactie. M1 macrofagen kunnen ook collagenase produceren, een zeer actief enzym dat de afbraak van collageen veroorzaakt, wat resulteert in een lage anastomotische sterkte vroeg na de vorming van een anastomose. In de late ontstekingsfase, met overmatige fagocytose van apoptotische neutrofielen, activeert de binding van β2 integrines op macrofagen door apoptotische neutrofielen macrofagen om de ontstekingsremmende mediatoren transformerende groeifactor (TGF) tot expressie te brengen. Daarentegen werd de productie van pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en IL-1β geremd. Aldus schakelt het fenotype van macrofagen over van pro-inflammatoire M1-achtige naar anti-inflammatoire M2-achtige. Deze macrofagen produceren cytokinen zoals IL-10 en leggen de basis voor de vorming van nieuw weefsel door de afscheiding van andere groeifactoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) . Omdat macrofagen gestimuleerd met IL-10, TGF, of glucocorticoïden in vitro polariseren in het M2c subtype dat overeenkomsten vertoont met ontstekingsremmende macrofagen, suggereert dit dat ontstekingsremmende macrofagen behoren tot macrofagen van het M2c-type en in staat zijn hun ontstekingsremmende respons te versterken door IL-10 en TGF uit te scheiden in een feedforward loop. Bovendien werd aangetoond dat de anti-inflammatoire en regeneratieve capaciteiten van anti-inflammatoire macrofagen volledig IL-10-afhankelijk zijn in steriele omgevingen, bijvoorbeeld in chirurgische wonden. Nieuwe weefselvorming
In deze fase genereren macrofagen die in weefsel verblijven of uit perifeer bloed worden gerekruteerd, bekend als profibrotische macrofagen, verschillende groeifactoren zoals TGF, van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), fibroblast groeifactor-2, of insuline-achtige groeifactor-1 . TGF is een profibrotisch cytokine dat inwerkt op fibroblasten en hen activeert om te differentiëren tot myofibroblasten in wondweefsel. Myofibroblasten produceren een massa van extracellulaire matrix (ECM) componenten waaronder collageen en fibronectine om het weefseldefect op te vullen. In het maagdarmkanaal kan collageen ook worden geproduceerd door gladde spiercellen. Collageen subtypes in het maagdarmkanaal zijn collagenen I, III, en V, in vergelijking met alleen collageen I en III in de huid. Door efficiënte contractiekrachten van myofibroblasten kan gebroken wondweefsel worden samengebonden en hun integriteit heropbouwen . Ondertussen geven profibrotische macrofagen en geactiveerde fibroblasten proangiogene factoren zoals VEGF af, die endotheelprogenitorcellen naar het wondweefsel doen kruipen, om de vorming van nieuwe bloedvaten (angiogenese) te bevorderen. Invasie van de capillairen verhoogt de bloedtoevoer naar de lokale weefsels en vergemakkelijkt de genezing van anastomosen. Verder hebben studies van het genezende colonslijmvlies van konijnen na experimentele excisie aangetoond dat een overvloed aan mesenchymale cellen in de genezende darmspierlagen gepaard gaat met capillaire invasie; deze cellen kunnen differentiëren in gladde spiercellen en histiocyten, waarvan wordt aangenomen dat zij verantwoordelijk zijn voor het herstel van glad spierweefsel. Profibrotische macrofagen, myofibroblasten en neovaten vormen samen granulatieweefsel, het belangrijkste fundamentele compartiment in het normale verloop van wondgenezing. Deze profibrotische macrofagen worden functioneel geclassificeerd als M2a-achtige macrofagen omdat zij in vitro kunnen worden geïnduceerd door IL-4 en IL-13 . Het is echter niet duidelijk of anti-inflammatoire en profibrotische macrofagen duidelijk kunnen worden onderscheiden in vivo, en het lijkt erop dat macrofaag plasticiteit een mengsel of continue variant verschuivingen creëert tijdens de wondgenezing .
1.2.3. Remodeling
Remodellering van anastomose is een dynamisch proces van maturatie binnen genezen weefsel dat gebaseerd is op een evenwicht tussen ECM depositie en afbraak en weefsel remodellering . Een deel van de in het weefsel verblijvende macrofagen, fibrolytische macrofagen genoemd, is van cruciaal belang voor het handhaven van dit dynamische evenwicht. Zij produceren matrixmetalloproteïnasen zoals matrixmetalloproteïnase-2 (MMP2), matrixmetalloproteïnase-9 (MMP9), matrixmetalloproteïnase-12 (MMP12) en matrixmetalloproteïnase-19 (MMP19) voor de afbraak van matrixmacromoleculen, met name collageen, een van de belangrijkste bestanddelen van ECM. De submucosa is een sterke laag van het maagdarmkanaal en bestaat voornamelijk uit collageen, en de remodellering van deze laag is bepalend voor de sterkte van de anastomose. Afhankelijk van de MMP’s die door fibrolytische macrofagen worden afgescheiden, worden de aanvankelijk afgezette collageenvezels herschikt en vernet, en wordt het type III collageen omgevormd tot type I collageen; dit laatste is veel sterker. Bovendien regelen fibrolytische macrofagen ook de afbraak door de synthese van de weefselremmer van metalloproteïnasen (TIMPs), die de activiteiten van MMP’s kunnen remmen. Verder zijn fibrolytische macrofagen verantwoordelijk voor de inductie van fibroblast apoptose, de daaropvolgende verwijdering van apoptotische cellen, en de onderdrukking van verdere ontsteking via IL-10 afgifte. Fibrolytische macrofagen worden voorgesteld om te worden geclassificeerd als M2c-achtige macrofagen die in vitro kunnen worden opgewekt door apoptotische cellen en IL-10 .
Dus, macrofagen nemen deel aan het hele fysiologische verloop van anastomotische genezing. In de drie belangrijkste fasen van weefselherstel brengen macrofagen in verschillende fasen verschillende fenotypen tot expressie. Er zijn ten minste vier soorten macrofagen in een toestand van normaal weefselherstel: (1) pro-inflammatoire macrofagen, (2) anti-inflammatoire macrofagen, (3) profibrotische macrofagen, en (4) fibrolytische macrofagen. Als we deze vier soorten macrofagen indelen volgens het “M1-M2” paradigma, kunnen pro-inflammatoire en profibrotische macrofagen respectievelijk overeenkomen met macrofagen van het M1-type en het M2a-type. Ondertussen, zowel anti-inflammatoire en fibrolytische macrofagen waarschijnlijk behoren tot M2c-type macrofagen .
1.3.
1.3. Rollen van Macrofagen in Anastomotic Leakage
Zoals we eerder in ons overzicht hebben besproken, bevat het optreden van AL voornamelijk drie factoren: communicatie, infectie, en genezingsstoornissen. Communicatie betekent defect van het spijsverteringskanaal in het anastomotische gebied dat de gastro-intestinale lumina en de buikholte verbindt. Infectie duidt op een bacteriële infectie van de anastomotische plaats. Genezingsstoornissen omvatten alle stoffen die een normaal genezingsproces verstoren, zoals hypoxie of ontsteking. Deze drie factoren werken actief op elkaar in: één factor vindt plaats, en een responsieve keten die bestaat uit alle factoren wordt in gang gezet, wat uiteindelijk leidt tot AL. Bijvoorbeeld, infectie lokt een ontstekingsreactie uit op de anastomotische plaats, die de collageenafzetting belemmert, vervolgens het normale genezingsproces verstoort, en leidt tot een communicatie tussen de intra- en extraluminale gastro-intestinale wanden. Integendeel, door communicatie kan de darminhoud (inclusief bacteriën) in de buikholte terechtkomen, een intra-abdominale infectie veroorzaken, en vervolgens de genezing van de anastomose vertragen. Klinisch wordt communicatie in zekere mate beschouwd als een macroscopisch klinisch resultaat, terwijl infectie en stoornissen in de genezing duurzame biologische processen zijn. Voor AL zijn macrofagen voornamelijk betrokken bij de laatste twee mechanismen, wat ook wordt waargenomen bij andere slecht genezen wonden.
Anastomotische infectie kan worden veroorzaakt door anastomotische dehiscentie (darminhoud lekt naar de steriele buikholte) of pre-/intraoperatieve besmetting. Ongeacht de oorzaak van de infectie, polariseren macrofagen in de besmettelijke infectieuze omgeving in het M1 type zoals hierboven vermeld. In plaats van de resistentie tegen intracellulaire bacteriën te ondersteunen en de acute fase van de infectie onder controle te houden, is een overmatig of langdurig M1 programma echter schadelijk voor de patiënt, zoals aangetoond bij acute infecties met Escherichia coli . E. coli als darmflora kan een typisch M1-profiel induceren door de herkenning van lipopolysacchariden (LPS) door TLR4 . Klassiek geactiveerde M1-type macrofagen verhogen de expressie van induceerbaar stikstofoxide synthase (iNOS), dat verantwoordelijk is voor de productie van stikstofmonoxide (NO). NO werd voor het eerst geïdentificeerd als mediërend bij arteriële vaatverwijding en bleek vervolgens een rol te spelen bij de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers. Bovendien is een prominente rol voor NO bij collageenafzetting, fibrose en littekenvorming beschreven. Hoge niveaus van wond-NO, zoals bij infectie of ontsteking, belemmeren de wondcollageensynthese ernstig. Verminderde afzetting van collageen verzwakt de anastomotische sterkte ernstig, wat kan leiden tot het falen van anastomotische genezing. Daarom draagt onjuiste M1 polarisatie van macrofagen bij bacteriële infectie van de buikholte bij tot het ontstaan van AL.
De rol van macrofagen bij lekkage met stoornissen in de genezing is gecompliceerder. In een normale toestand begint weefselherstel met het opruimen van weefselresten en dode cellen, waarbij deze “weefselvuilnis” efficiënt wordt gefagocytoseerd door macrofagen, en is van cruciaal belang voor het tijdig oplossen van ontstekingen en een succesvolle genezing. Niettemin, bij patiënten die gecompliceerd zijn met diabetes mellitus, ouder worden of chemotherapie hebben ondergaan, wordt het vermogen van macrofagen om te fagocytoseren sterk beïnvloed, wat rechtstreeks leidt tot een ophoping van apoptotische of necrotische cellen op de plaats van de anastomose. Deze ophoping van dode cellen verlengt de ontstekingsfase, verstoort het genezingsproces en brengt de oplossing van de ontsteking in gevaar. Andere verstoringen zoals ischemie of anastomotische hypoxie brengen de genezing van de anastomose ernstig in gevaar. Op cellulair niveau leidt blootstelling van macrofagen aan een zuurstofarme omgeving tot de expressie van proinflammatoire cytokines zoals IL-1β en TNF-α en cytotoxische mediatoren zoals NO , wat erop wijst dat hypoxie macrofagen kan aanzetten tot polarisatie in het M1 fenotype. Overmatig geactiveerde M1 macrofagen ondersteunen een pro-inflammatoire respons en belemmeren de volgende stappen van het herstelproces dat een goede genezing en remodellering van anastomose beïnvloedt, en het relevante mechanisme is hierboven beschreven.
Gebaseerd op het beschikbare bewijsmateriaal, lijkt het erop dat klassiek geactiveerde macrofagen die het M1 fenotype tot expressie brengen verantwoordelijk zijn voor het pathologische proces van defecte anastomotische genezing, terwijl alternatief geactiveerde macrofagen die het M2 fenotype tot expressie brengen een cruciale rol spelen in het oplossen van ontstekingen en succesvol weefselherstel (figuur 2). Hoewel macrofagen van het M1-type deelnemen aan de vroege fase van normale wondgenezing, legt de geprogrammeerde transformatie van hun gepolariseerde oriëntatie van M1 naar M2 de basis van voorbijgaande ontstekingsreactie en de daaropvolgende weefselregeneratie.
2. Conclusie
Macrofagen zijn de meest veelzijdige immuuncellen en bezitten een aanzienlijke plasticiteit en heterogeniteit. Macrofagen kunnen polariseren in twee belangrijke uitersten en overeenkomstige fenotypes tot expressie brengen (M1 en M2). Aangezien polarisatie de premisse is voor macrofagen om hun diverse biologische functies uit te oefenen, spelen verschillende gepolariseerde macrofagen verschillende rollen in het fysiologische proces van anastomotische genezing en de pathogenese van AL. Het herontdekken van AL in het perspectief van macrofagen draagt bij tot de exploratie van nieuwe diagnostische middelen en therapeutische doelen. Bijvoorbeeld, in verschillende herstelfasen na anastomose aanleg, kan het spectrum van cytokines en inflammatoire mediatoren zoals IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, ROS, en NO, die door macrofagen worden afgescheiden, een verandering vertonen. Bovendien zou het niveau van deze stoffen indirect de situatie van een anastomose kunnen weerspiegelen. Een abnormale fluctuatie van deze stoffen duidt waarschijnlijk op stoornis en defect van de genezing van de anastomose, hetgeen kan worden beschouwd als een voorbode van AL. Omdat M1-type macrofagen een stimulerend effect hebben op AL en M2 macrofagen essentieel zijn voor de genezing van anastomosen, kan regulatie van M1/M2 polarisatie in de toekomst een therapeutische rol spelen bij de behandeling van AL.
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Authors’ Contributions
Jinyao Shi en Zhouqiao Wu zijn de eerste auteurs.
Acknowledgments
Dit artikel is ondersteund door de Beijing Municipal Science and Technology Commission (nos. D141100000414004 en Z151100004015070) en Beijing Municipal Commission of Health and Family Planning (no. 2014-1-2151).