Abstract
In 1992 rapporteerden we een nieuwe methode voor het sequencen van eiwitten vanaf de carboxy-terminus (C-terminus) (Boyd et al., 1992). In de afgelopen 2 jaar hebben we ons onderzoek voortgezet, inclusief het mechanisme van de initiële activering van de C-terminale carboxylgroep en de doelbewuste modificaties van de reactieve zijketens van de aminozuren met de sequencing reagentia. Door de keuze van de reagentia en reactie-omstandigheden die voor ons sequencing-protocol worden gebruikt, worden asparaginezuur, glutaminezuur, serine en threonine gederivatiseerd. De amidatie van asparaginezuur en glutaminezuur en de acetylering van serine en threonine hebben geleid tot een beter rendement bij het sequencen van deze residuen. Asparaginezuur en glutaminezuur zijn nu gecategoriseerd, zoals te zien is in tabel 1, als aminozuurresiduen die gemakkelijk te sequencen zijn. Onze criteria om te bepalen of een residu betrouwbaar wordt genoemd, is de mogelijkheid om dat residu te sequencen en op te sporen wanneer het aanwezig is in één nanomole van een eiwitmonster. Gemiddeld is het mogelijk 5 cycli te sequensen op één nanomole eiwit dat op een polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan is aangebracht, als de aminozuursequentie de residuen bevat die in de kolom “betrouwbaar genoemd” van tabel 1 zijn vermeld. Ons doel voor de MPSA-conferentie van 1994 is de huidige bruikbaarheid van deze C-terminale sequencing-methode te illustreren bij de sequencing van eiwitten die op PVDF zijn geïmmobiliseerd.