TEXT
Humane influenzavirussen infecteren gewoonlijk de bovenste luchtwegen en veroorzaken niezen, een loopneus en hoesten, evenals koorts, malaise, en gewrichtspijn (22). Daarnaast zijn ook neurologische complicaties gemeld wanneer een nieuw subtype van het influenzavirus bij de menselijke bevolking wordt geïntroduceerd, zoals bij de Spaanse (1918) en Aziatische (1957) pandemieën het geval was (2-4, 6, 10, 18, 22).
In 1997 veroorzaakte het H5N1 influenzavirus, dat afkomstig was van pluimvee, een uitbraak bij de mens. Sindsdien zijn wereldwijd meer dan 500 mensen besmet geraakt met H5N1-virussen, met een sterftecijfer van ongeveer 60% (21). Besmetting met het menselijke H5N1-virus manifesteert zich meestal als een ernstige longontsteking, die evolueert naar een acuut ademnoodsyndroom; sommige slachtoffers van het H5N1-virus hebben echter neurologische letsels opgelopen (1). H5N1 viraal RNA en antigenen zijn gedetecteerd in de hersenen van patiënten, en het virus zelf is geïsoleerd uit cerebrospinaal vocht (5, 7) Deze gegevens suggereren dat sommige H5N1 virussen encefalitis bij mensen kunnen veroorzaken, zoals voorkwam in de vroege fasen van de Spaanse en Aziatische pandemieën.
Fretten vormen een nuttig zoogdiermodel voor influenza-infectie omdat ze zeer gevoelig zijn voor infectie met influenzavirussen en een aantal van de symptomen van influenza ontwikkelen die bij de mens worden waargenomen (8, 12, 14, 16, 19). De neuro-invasiviteit van een H5N1 influenzavirus na intranasale blootstelling is ook gerapporteerd in een frettenmodel (23). Om de neurologische effecten van een H5N1 virusinfectie op lange termijn te bestuderen, hebben wij fretten geïnfecteerd met H5N1 virussen die milde symptomen bij deze dieren veroorzaken en hebben wij de effecten op het centrale zenuwstelsel (CZS) gedurende 9 maanden geobserveerd. We hebben ook getracht de route te achterhalen waarlangs deze H5N1 virussen het CZS binnendrongen.
Zesen maanden oude fretten werden intranasaal geïnoculeerd met 106 PFU van A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) of A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486) virus. Deze virussen werden gekweekt in Madin-Darby canine kidney (MDCK)-cellen in minimaal essentieel medium, aangevuld met 0,3% boviene serumalbumine. Op dag 3, 6, en 12 en maanden 1, 3, 6, en 9 na infectie (p.i.), namen we weefselmonsters voor virusisolatie en pathologisch onderzoek. De fretten waren lethargisch en vertoonden tekenen en symptomen van infectie van de luchtwegen gedurende de eerste 10 dagen p.i. maar geen merkbare neurologische tekenen, wat in contrast staat met eerder gerapporteerde resultaten (23). Weefselmonsters van neusturbbinaten, longen, luchtpijp, hersenen, lever, milt, nieren, hart, pancreas en ruggenmerg werden geoogst en gehomogeniseerd tot een suspensie van 10% met een fosfaatgebufferde zoutoplossing. De virustiter in elk weefsel werd bepaald met behulp van plaque-assays. De virussen vermenigvuldigden zich voornamelijk in de neusturbines, waarbij de virustiters 105 tot 106 PFU/gram weefsel bereikten na 3 tot 6 dagen p.i. (tabel 1). Hersenweefsel verzameld van HK483- of HK486-geïnfecteerde fretten werden bewaard in 10% neutraal gebufferde formaline en verwerkt voor paraffine embedding. De paraffine ingebedde weefsels werden gesneden in 5-mm-dikke plakjes en gekleurd met hematoxyline en eosine (H1802>E). Bijkomende secties werden uitgesneden voor immunohistologische kleuring met polyklonale konijnantilichamen tegen een H5 influenzavirus. Histologisch onderzoek toonde neuronale invasie of beschadiging, inclusief ontsteking van de plexus choroideus (tabel 2). Fretten geïnfecteerd met het HK486 virus vertoonden tekenen van nonsuppuratieve ontsteking (Fig. 1a) en virale antigeenexpressie (Fig. 1b) die 12 dagen aanhielden; virale antigenen werden niet gedetecteerd na 1 maand p.i. De nonsuppuratieve encephalitis duurde 3 maanden (Fig. 1c), met residuele gliale littekenvorming zichtbaar na 6 en 9 maanden p.i. in de gebieden waar virale antigenen werden gedetecteerd in de eerdere fase (Fig. 1d). Verder vertoonden met HK486 geïnfecteerde fretten macroscopisch letsel van het reukorgaan op dag 12 p.i. (Fig. 1e en f). Deze bevindingen suggereren dat, hoewel hoog pathogene H5N1 virussen voornamelijk de luchtwegen van de gastheer aantasten (1), zij ook neurologische complicaties kunnen veroorzaken. In tegenstelling tot het HK486-virus, dat het hersenparenchym van fretten binnendrong en ernstige parenchymschade veroorzaakte, veroorzaakte de tweede H5N1-stam, HK483, ernstige niet-suppuratieve vasculitis zonder duidelijke parenchymschade in de hersenen van fretten op 6 dagen p.i. Hoewel geen viraal antigeen kon worden aangetoond in de vasculatuur, was vasculaire schade duidelijk, gekenmerkt door endotheliale zwelling (Fig. 2a, pijlpunten), verspreide apoptotische cellen (Fig. 2b, pijlpunten), en intramurale infiltratie van macrofagen (Fig. 2a, pijlen) en polymorphonucleaire leukocyten (Fig. 2b, pijl). Vasculaire laesies werden gevonden in de thalamus, op de overgang tussen de grijze en witte stof, en in de hersenstam. Hersenmonsters die na 1 en 6 maanden p.i. werden onderzocht, vertoonden hemorragische laesies die wezen op chronische en herhaalde perivasculaire bloeding (Fig. 2c) in de thalamus, het cerebellum en de subarachnoïdale ruimte van de voorhersenen (Fig. 2d). Deze waarnemingen komen overeen met rapporten van door het influenzavirus veroorzaakte hemorragische complicaties van de hersenen tijdens jaarlijkse epidemieën (11). Hersenvasculitis secundair aan virale infectie komt relatief vaak voor (17) en is waarschijnlijk de oorzaak van vaatwandfragiliteit, leidend tot hersenbloedingen. Het lijkt daarom redelijk te concluderen dat infectie met het H5N1-virus bij de mens hersenbloedingen kan veroorzaken die vergelijkbaar zijn met die welke worden gezien bij infectie met andere neurotropische virussen.
- View inline
- View popup
Virus recovery from tissues of ferrets infected with the HK483 or HK486 H5N1 virus
- View inline
- View popup
Prevalentie van hersenletsels bij fretten op verschillende tijdstippen na infectie met hoogpathogene H5N1-influenzavirussen
Hersenletsels bij met HK486 virus geïnfecteerde fretten. (a) Ernstige niet-suppuratieve encefalitis in het olfactorische gebied op dag 6 na infectie (p.i.). (b) Virale antigeenexpressie in een hersenlaesie op dag 12 p.i. Neuronale en gliale cellen zijn gekleurd met anti-H5 virus antiserum. (Inzet) Niet-geïnfecteerde neuronen en glia. (c) Smoltende encefalitis in hersenweefsel op 3 maanden p.i. (d) Perivasculaire gliale littekenvorming op 9 maanden p.i. (e) Macroscopisch zichtbare hersenlaesie in een deel van het olfactorisch systeem (piriforme kwab) op dag 12 p.i. (f) Gedeeltelijk verlies van een olfactorische bol (bovenzijde van de hersenen) als gevolg van virale encefalitis op 1 maand p.i. Vergelijk deze beelden met de hersenen van een leeftijd-gematchte controle (onderste hersenen).
Hersenletsels in HK483 virus-geïnfecteerde fretten. (a) Prominente niet-suppuratieve vasculitis op dag 6 p.i. Let op de ernstige zwelling van een vasculaire endotheelcel (pijlpunten) en migratie van macrofagen in de vasculaire wand (pijlen), vergeleken met het normale uiterlijk van het omliggende hersenparenchym. (b) Verspreide apoptotische cellen (pijlpunten) en polymorfonucleaire leukocyten (pijl) in de vaatwand op dag 6 p.i. (c) Oude en verse hemorragische laesies in de thalamus van een fret die necropsie onderging op 6 maanden p.i. (pijlpunten, met hemosiderine beladen macrofagen in een oude laesie; pijlen, verse hemorragie met rode bloedcellen). (d) Verse subarachnoïdale bloeding in de hersenen van een fret op 6 maanden p.i. Let op de ophoping van rode bloedcellen tussen leptomeninges (gestippelde zwarte lijn) en arachnoid mater (gestippelde rode lijn).
Om de route waarlangs H5N1 virussen de hersenen van fretten binnendringen te onderzoeken, analyseerden we de verdeling van hersenletsels en virale antigeenexpressie waargenomen bij fretten geïnfecteerd met de HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204), en A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18) virussen. De HK213, VN1204, en NCVD18 virussen werden gekweekt in MDCK cellen in minimaal essentieel medium aangevuld met 0.3% boviene serum albumine. Zes maanden oude fretten werden intranasaal geïnoculeerd met 106 PFU van het virus. Hersenweefsel werd verzameld in de acute fase, op 3 en 6 dagen na infectie voor VN1204 en NCVD18, en bovendien op 12 dagen na infectie voor HK213. De weefsels werden verwerkt voor H1802>E kleuring en immunohistochemie voor histologisch onderzoek. De hersenen parenchymale laesies geproduceerd door VN1204, NCVD18, en HK213 werden gekenmerkt door nonsuppuratieve encefalitis, en het uitdrukkingspatroon van virale antigenen was in wezen hetzelfde als die van HK486 (gegevens niet weergegeven). Om de drie-dimensionale (3D) verdeling van de hersenletsels en virale antigenen te begrijpen, hebben we uitgezet ze door 3D beeldvorming (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co, Ltd., Japan) van een gele mangoest (Cynictis penicillata) hersenen, waarvan de architectuur lijkt sterk op die van de fret hersenen (20). Voor het visualiseren van de olfactorische route (dat wil zeggen, de sensorische route voor het gevoel van geur), markeerden we de zenuwbanen van de bulbus olfactorius naar de piriform cortex op de 3D-beelden als een referentiekader (Fig. 3a, geel; zie ook Movie S1 in het aanvullend materiaal). We vonden drie verschillende patronen van hersenletsels, met en zonder virale antigenen, veroorzaakt door de verschillende H5N1 influenzavirussen: die alleen verspreid langs de olfactorische route (Fig. 3b en c, gestippelde gele lijn; zie ook Movies S2 en S3) (HK213 en NCVD18); die gedetecteerd langs de olfactorische route (Fig. 3d en e, gestippelde gele lijn; zie ook Movies S4 en S5) en in de hersenstam (Fig. 3d en e, witte pijlen; zie ook Movies S4 en S5) (HK486 en VN1204); en die in andere gebieden (Fig. 3f; zie ook Movie S6) (HK483). De basis voor het scheiden van de derde groep van laesies van de andere twee groepen is duidelijker wanneer de laesie distributies worden onderzocht vanaf de achterzijde (Fig. 3g en h, geel versus blauw versus rood). Deze karteringsresultaten geven aan dat de meeste van de geteste H5N1-stammen de hersenen binnendrongen via de olfactorische route (Fig. 3, gele stippellijn). Een uitzondering was de HK483 stam (Fig. 3f), die duidelijk gericht op de hersenen vasculatuur in fretten, het produceren van laesies buiten de olfactorische system.
Distributie van hersenletsels na infectie met de HK483, HK486, HK213, NCVD18, of VN1204 stam van het H5N1 virus. Hersenletsels zijn in kaart gebracht op drie-dimensionale beelden van de hersenen van een gele mangoest. Geselecteerde delen van de hersenen secties werden geanalyseerd, daarom, de plots van de laesie locaties zijn discontinue. (a) Olfactorische route (geel). De verdeling van laesies en virale antigenen (rood) geassocieerd met HK213 (b) of NCVD18 (c) infectie volgt de olfactorische route (gestippelde gele lijn). Bij dieren geïnfecteerd met HK486 (d) of VN1204 (e), de laesies en virale antigenen bevinden zich in de hersenstam (witte pijlen) en de olfactorische route (rode percelen binnen de gestippelde gele lijn). De HK483 stam (f) veroorzaakt ernstige schade aan de bloedvaten, met duidelijke hemorragische laesies (blauwe plots). (g) Achteraanzicht van de olfactorische route (gele plots). (h) Achteraanzicht van HK483-geïnduceerde hemorragische laesies (blauw) en vasculitis (rood) buiten de olfactorische route. Panelen a tot f zijn ventrale aanzichten.
Voordat H5N1-virussen pandemisch kunnen worden, zullen ze waarschijnlijk het vermogen moeten verwerven om goed te groeien in het bovenste deel van de menselijke luchtwegen, wat zou leiden tot efficiënte overdracht van mens op mens via niezen en hoesten (13, 22). Onze gegevens van fretten suggereren dat als hoogpathogene H5N1-virussen deze voet aan de grond krijgen bij mensen, zij subklinische neurologische complicaties zouden kunnen veroorzaken door de hersenen binnen te dringen via de zenuwbanen of door hersenvasculitis te veroorzaken. Eerder werd een H3N2 virus gedetecteerd in frettenhersenen; de hoeveelheid virus in de hersenen was echter laag (minder dan 102,2 log10 50% ei-infectieuze doses) en er werd geen bewijs van virusantigenen in de hersenen gerapporteerd (23). Wij vonden dat het pandemische H1N1-virus van 2009 zich efficiënter in de luchtwegen van fretten vermenigvuldigde dan een humaan seizoensgebonden H1N1-virus (9, 13, 15) en nonsuppuratieve olfactorische bollaesies veroorzaakte; wij vonden echter geen virus in het hersenparenchym van deze dieren (gegevens niet aangetoond). Daarom is hersenparenchym-invasie, zoals aangetoond door de aanwezigheid van virale antigenen, een kenmerk van H5N1-virussen. Het zou daarom relevant zijn om retrospectieve en prospectieve studies uit te voeren naar subklinische neurologische complicaties bij patiënten die besmet zijn met het H5N1-virus. Onze bevindingen wekken de zorg dat subklinische neurologische complicaties gepaard zouden kunnen gaan met ernstige respiratoire infecties bij de wereldwijde verspreiding van H5N1-virussen.