Historical review
Verkenningen van traumatisch veroorzaakte axonale afwijkingen in de meeste experimentele modellen van stomp hoofdletsel, zonder myelineverstoring of duidelijke beschadiging van de aangrenzende neurale of gliale processen, hebben geen bewijs geleverd voor direct scheuren of afschuiven van axonen na traumatisch letsel.910 Dit werd ondersteund door vriesfractuur studies, uitgevoerd in de vroege fasen van axonaal letsel, die geen onmiddellijke verstoring van de internodale myeline of vroeg verlies van de gliale-axonale verbindingen aantoonden, wat suggereert dat de myelineschede zelf niet onmiddellijk beschadigd wordt door de krachten van het letsel.23 In dit stadium stelden beide bovengenoemde groepen dat de krachten van het traumatisch letsel eerst inwerken op het axolemma of het axoplasma, terwijl de myelineschede gespaard wordt. Binnen deze hypothese zouden de mechanische krachten van het letsel het axolemma kunnen rekken of verwonden tot aan zijn biomechanische grenzen, op welk punt ionische homeostase zou falen en reactieve axonale verandering zou initiëren.
Het is echter zo dat in een reeks van latere onderzoeken op hersenweefsel van zowel mensen1222 als dieren2124 , Povlishock en collega’s gegevens verstrekten die een initiërende rol voor het intra-axonale cytoskelet ondersteunden. Hun studies onthulden een complexe opeenvolging van intra-axonale gebeurtenissen die uitmondden in reactieve axonale verandering. Specifiek, gebruikmakend van antilichamen gericht tegen de neurofilament component van het cytoskelet, ontdekten zij dat er een focale accumulatie was van de 68 kDa subeenheid (NF-L) binnen een uur na verwonding en deze toename was dramatisch na twee uur. Met toenemende tijd werden de neurofilamenten gedesorganiseerd en scheefgetrokken ten opzichte van de lengteas van het axon. Er werd geen verlies of ontbinding van neurofilamenten geconstateerd. Deze gegevens waren daarom niet consistent met neutrale protease gemedieerde degradatie van het cytoskelet. In plaats daarvan ondersteunde de toename van de 68kDa neurofilamentsubeenheid de mogelijkheid van een traumatisch geïnduceerde herschikking van de neurofilamentpool. Verder werd in deze serie experimenten geen ultrastructureel bewijs van directe axolemmale verstoring gevonden. Plooiing en uitzetting van de axolemma werd gevonden en toegeschreven aan de voortgaande reactieve axonale verandering. Deze bevindingen suggereerden dat een direct mechanisch effect op het cytoskelet van de axon cilinder de centrale gebeurtenis was in de initiërende pathogenese van axonaal letsel.
Andere benaderingen suggereerden dat de axolemma betrokken was bij de initiatie van reactieve axonale verandering. Maxwell et al. gebruikten een zenuwtractiemodel om de morfologische veranderingen binnen beschadigde axonen te analyseren.18 Deze auteurs leverden bewijs dat de eerste plaatsen van beschadiging, na een niet-disruptief rekletsel, de knopen van Ranvier zijn, waarvan sommige “nodale blebs” ontwikkelen. Deze blebs zijn axolemma beperkte uitsteeksels van het axoplasma in de perinodale ruimte en zijn het talrijkst binnen 15 minuten na beschadiging, maar minder talrijk op latere tijdstippen. De ontwikkeling van nodale blebs correleerde met verlies van de dichte onderlaag van het axolemma. In beschadigde axonen met nodale blebs waren de neurofilamenten gedesorganiseerd, weken af van de longitudinale as van het axon, en strekten zich uit in de blebs. De microtubuli daarentegen behielden hun longitudinale ordening en weken niet uit naar de bleb. Kwantitatieve analyse van dit materiaal toonde aan dat er een significant verlies was van microtubuli en een verhoogde afstand van neurofilamenten in het axoplasma van knooppunten met geassocieerde nodale blebs. Dit verlies van microtubuli zou snel axoplasmatisch transport kunnen verstoren, resulterend in de focale accumulatie van membraneuze organellen in aangrenzende paranodale gebieden van het axon om axonale zwellingen te vormen. Bovendien leverden deze onderzoekers het eerste cytochemische bewijs ter ondersteuning van het idee van instroom van calcium in gemyeliniseerde zenuwvezels die door rek verwond zijn.25 Gebruik van de oxalaat-pyroantimonaat techniek voor de lokalisatie van calcium toonde een verhoogd gehalte aan pyroantimonaat precipitaat binnen nodale blebs 15 minuten na rekverwonding. Dit correleerde met een vermindering van de labelling voor membraanpomp Ca2+ATPase activiteit op de nodale axolemma.26 De knoop van Ranvier is het gespecialiseerde gebied van de axolemma waarin groepen Na+ kanalen, ATPase aangedreven pompen voor calcium, en een Na+/Ca2+ wisselaar gelokaliseerd zijn.2027 Daarom zou verlies van membraanpomp activiteit in de nodale axolemma een mechanisme kunnen verschaffen voor instroom van vrij calcium in knopen van Ranvier na traumatisch letsel. Dit bewijs ondersteunt de hypothese dat de krachten van traumatisch letsel resulteren in een focale pertubatie van de axolemma met de resulterende influx van vrij calcium dat in staat is om een subpopulatie van neutrale proteasen te activeren.25
Biofysisch onderzoek heeft nieuwe technieken gebruikt om de axolemma te analyseren in experimentele omstandigheden die analoog zijn aan axonaal letsel. Na licht rekletsel treedt een reeks van vernauwingen en uitbreidingen op in nervus ischiadicusvezels van de volwassen rat. Deze vormverandering staat bekend als beading.28-30 De transformatie van de in essentie cilindrische vorm van de normale zenuwvezel naar een zenuwvezel die beading vertoont, gebeurt snel, binnen 10 tot 20 seconden na het begin van de rek. De eerste experimentele gegevens suggereerden dat beading tot stand komt door een mechanisme dat verband houdt met het axolemma, het cytoskelet, of beide. In dit model bindt het transmembraaneiwit β1-integrine zowel aan de extracellulaire matrix als aan het cytoskelet.14 Spanning op de extracellulaire matrix wordt via β1-integrine doorgegeven aan het cytoskelet, waardoor de integriteit en ruimtelijke ordening van het cytoskelet veranderen. Een recente studie heeft echter aangetoond dat beading geen onderling verbonden cytoskelet vereist en concludeerde dat de axolemma de initiërende plaats of locus van beading vernauwing is.31 Het is het waard om te speculeren dat beading deel kan uitmaken van het biologische proces dat wordt beschreven als reactieve axonale verandering in de literatuur met betrekking tot traumatisch geïnduceerd axonaal letsel.
In de afgelopen vier jaar is de betrokkenheid van de axolemma in de pathogenese van axonaal letsel vast komen te staan. Maxwell et al toonden aan dat ernstig traumatisch hersenletsel veroorzaakt door laterale versnelling in staat was om het axolemma direct te scheuren bij niet-menselijke primaten.32 Deze studie was de eerste die ultrastructureel bewijs leverde dat het concept van axonale afschuiving bij traumatisch hersenletsel ondersteunde. Het verlies van axolemmale integriteit werd geassocieerd met snelle ontbinding van het axonale cytoskelet. In de axonen die axolemmale scheuring of fragmentatie vertoonden, werd de filamenteuze organisatie van het cytoskelet vervangen door een vlokkig neerslag consistent met een snelle ontbinding van de onderliggende cytoskelet-eiwitten. Deze veranderingen werden waargenomen binnen enkele minuten na het letsel, maar traden alleen op in een subpopulatie van fijnkaliber, dungemyeliniseerde axonen na ernstig letsel. Deze morfologische veranderingen vertegenwoordigden een acute reactie van axonen op verwonding en werden “primaire axotomie” genoemd – gedefinieerd als optredend binnen enkele minuten na verwonding, in tegenstelling tot vertraagde secundaire axotomie, die zich ontwikkelt over een periode van uren. In hetzelfde experimentele materiaal was er geen bewijs van verstoring van de axolemma een uur na verwonding. Dit suggereert dat het verstoorde axonale membraan binnen een uur na verwonding weer sluit.
Na deze publicatie heroverwogen Povlishock en collega’s hun centrale hypothese, waarin geen rol was weggelegd voor het axolemma bij het ontstaan van traumatisch veroorzaakt axonaal letsel. Bij nader inzien stelden zij voor dat een directe scheuring van de axolemma de ernstigste vorm van axolemmale verstoring zou kunnen zijn.33 Dit was een belangrijk keerpunt, omdat deze onderzoeksgroep jarenlang had gesteld dat er geen bewijs was voor directe veranderingen in de axolemma na verwonding in de talrijke paradigma’s die zij hadden onderzocht. Bovendien hadden zij betoogd dat de pathobiologie van traumatisch geïnduceerd axonaal letsel resulteerde uit de directe aantasting van axoplasmatisch transport ten gevolge van de krachten van het letsel die direct het axonale cytoskelet verstoorden.71221
In een serie experimenten, ontworpen om dit te onderzoeken, gebruikten Povlishock en collega’s de extracellulaire tracer, mierikswortelperoxidase (HRP), om te bepalen of directe veranderingen in het axolemma detecteerbaar waren bij traumatisch hersenletsel van lichte en matige ernst.3334 Deze nieuwe benadering was gebaseerd op het principe dat macromoleculaire tracers zoals HRP normaal gesproken uit het axoplasma worden geweerd door een intact axolemma. Daarom zou detectie van intra-axonale peroxidase activiteit een bewijs zijn van axolemmale verstoring. Bovendien zou de plaats van peroxidase activiteit de initiële plaats van axonale pertubatie afbakenen, waardoor inzicht zou kunnen worden verkregen in de initiërende factoren die betrokken zijn bij de pathogenese van secundaire axotomie. Hun bevindingen toonden aan dat de pathobiologie van traumatisch geïnduceerd axonaal letsel een heterogeen en complex proces was waarbij meervoudige en gevarieerde initiërende pathologie betrokken was.
In het bijzonder bepaalde de ernst van het traumatisch letsel de daaropvolgende gebeurtenissen in het axolemma en het cytoskelet, resulterend in een differentiële respons op het letsel. In het bijzonder werden na matig letsel directe pertubaties van het axolemma waargenomen, tot uiting komend in een veranderde permeabiliteit voor macromoleculen.33-35 Dit ging gepaard met een snelle lokale verdichting van axonale neurofilamenten, blijkend uit een afname van de interfilament afstand. Na licht traumatisch hersenletsel werden echter geen aanwijzingen gevonden voor veranderingen in het axolemma en werd een andere set van cytoskeletale afwijkingen gevonden, met scheefstand en axonale zwelling. Een differentiële respons op verwonding was eerder beschreven in een model van axonaal letsel door compressiebelasting.36 Bij lage trekbelasting vertoonden axonen axonen axoplasmatische verstoring onafhankelijk van enige verandering in axolemmale integriteit, geheel consistent met de veranderingen beschreven bij licht traumatisch hersenletsel. Bij ernstiger letsels vertoonden dezelfde axonen axolemmale verandering die correleerde met dramatisch axoplasmatisch falen. Latere studies hebben deze bevindingen uitgebreid door aan te tonen dat deze veranderingen in het axolemma en in het cytoskelet noch modelspecifiek3435 noch soortspecifiek zijn.37 Bovendien, na het aantonen van traumatisch geïnduceerde veranderingen in axolemmale permeabiliteit suggereerden de studies dat calcium betrokken zou kunnen zijn bij de initiatie van cytoskeletale gebeurtenissen. Deze schijnbare tegenspraak met vroegere opvattingen kwam voort uit het feit dat zij veronderstelden dat calcium werkzaam was via voorheen niet geïdentificeerde mechanismen. In plaats van proteolytische enzymen te activeren, zou calcium minder dramatisch kunnen werken om de neurofilamentaire zijarmen te veranderen, waardoor de neurofilamenten samenvouwen, wat resulteert in hun verhoogde pakkingsdichtheid. Het is denkbaar dat deze neurofilament zijarmen ofwel worden gesplitst door calcium gemedieerde processen of gedefosforyleerd door de acties van kinasen en fosfatasen om te resulteren in verandering van de driedimensionale afstand van neurofilamenten.1
Concluderend, de controverse rond de rol van het axolemma in de pathobiologie van traumatisch veroorzaakt axonaal letsel is tot op zekere hoogte opgelost. Men is het er nu over eens dat verstoring van het axolemma de initiële gebeurtenis is in bepaalde vormen van traumatisch letsel. Echter, de mechanistische basis van secundaire axotomie wordt nu gezien als steeds complexer met veranderingen in het axonale cytoskelet aangetoond in de meer ernstige vormen van traumatisch hersenletsel.