Transcriptoom analyse van graanamarant (Amaranthus hypochondriacus) met 454 pyrosequencing: vergelijking met A. tuberculatus, expressieprofilering in stengels en in respons op biotische en abiotische stress

. tuberculatus, expressieprofilering in stengels en in reactie op biotische en abiotische stress

Roche GS-FLX en GS-FLXTM sequencing en assemblage

Zes sequencing runs leverden ≈910 Mb totale datagrootte op, gelijk aan 2.913.966 ruwe reads. De ruwe sequentie bestanden zijn beschikbaar bij de NCBI Sequence Read Archive (SRA) op http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?study=SRP006173, als bestanden SRR172675 (S1), SRR172676 en SRR183482 (S2), SRR172677 (S3), SRR172678 en SRR183483 (S4), SRR172679 (S5) en SRR172680 (S6). Lengtefrequentie verdeling van ruwe leest geclusterd rond de 200-tot-300 bp en 300-tot400 bp bereik als gevolg van het gebruik van twee verschillende platforms voor sequencing (Figuur 1A). Een totaal van 2.700.168 gelezen (93% van het totaal) ingevoerd in de assemblage proces dat 21.207 hoge kwaliteit geassembleerd sequenties (20.408 isotigs + 799 contigs ¸ gelijk aan 87% van de gelezen invoeren assemblage en ≈82% van alle geassembleerde sequenties) opgeleverd. Deze varieerden in lengte van 80 tot 3.379 bp (Figuur 1B) en had een gemiddelde sequentie lengte van 1.014 bp (isotigs) en 930 bp (contigs). Een totaal van 178.636 leest (≈6% van het totaal) bleef als singletons (dekking diepte = 1); van deze, slechts 5.113 schone sequenties bleef na kwaliteitscontrole. Isotigs werden verder opgenomen in 15.667 isogroepen. Een statusoverzicht van het sequentie-, assemblage- en annotatieproces (zie hieronder) wordt in tabel 1 gepresenteerd.

Annotatie van A. hypochondriacus contigs/isotigs

Alle contigs/isotigs werden voor annotatie vergeleken met de nr, TAIR, UniRef100, UniRef50 en Amaranthaceae ESTs en PFAM-databases. Ongeveer 82% van alle ingangen leverden significante treffers (E ≤ 1 × 10-10) op wanneer ze aan de nr database werden getoetst (Tabel 1). De 3.901 sequenties zonder significante treffer met de nr databank werden vergeleken met de PFAM eiwitdomeinen databank om hun vermoedelijke functie te bepalen. Slechts een klein deel van deze sequenties (≈2%) produceerde significante hits (E waarden ≤ 1 × 10-5) met bekende eiwitdomeinen. Deze resultaten zijn beschikbaar in Additional file 1. Annotatie van de 5.113 zuivere singletons tegen de TAIR database leverde ongeveer 1.000 significante hits.

De beste hit voor elke unigene bevraagd tegen de TAIR database werd gebruikt om functionele GO annotatie in termen van biologische proces (11.224 sequenties), moleculaire functie (11.499 sequenties) en cellulaire component (11.227 sequenties) groepen toe te wijzen. De resultaten zijn samengevat in figuur 2. Zoals verwacht werd het grootste percentage in elke GO-groep (12% tot 15%) gevormd door contigs/isotigs met een onbekende functionele annotatie. Geen duidelijke verschillen in het aantal sequenties toegewezen aan elke categorie, met inbegrip van respons op (a)biotische stress, werden waargenomen tussen graanamarant en Arabidopsis thaliana. Dit was waarschijnlijk een weerspiegeling van de bekende capaciteit van Arabidopsis om sterk te reageren op abiotische en biotische stress op transcriptioneel niveau. Dit resultaat pleit ook tegen de mogelijkheid dat graanamarant een andere transcriptomische signatuur bezit, met name in de categorieën stress en respons op stimuli, die zijn karakteristieke (a)biotische stresstolerantie zou kunnen verklaren, in tegenstelling tot wat is waargenomen bij plantensoorten die zijn aangepast aan extreme habitats (bv. de aan Arabidopsis verwante halofyt Thellungiella halophila en extremofiele mangroven). Zo gaf de functionele GO toewijzing voor Biologisch Proces (Figuur 2A) aan dat 3% van de contigs/isotigs gegroepeerd waren onder stress/stimuli respons, 2% in ontwikkelingsprocessen en nog eens 4% in andere biologische en metabole processen. Deze categorieën waren voor ons van bijzonder belang aangezien één van de hoofddoelstellingen van deze transcriptoom studie erin bestond informatie te verschaffen die leidt tot de identificatie van (a)biotische stress-responsieve genen (zie verder). Van het aantal transcripten waaraan een defensierol werd toegekend (1% van het totaal), werd meer dan de helft geassocieerd met bacteriële infectie (41%) en jasmonzuur (JA)-regulatie (24%), waaronder veel JA-biosynthetische (bv. LOX13, AOS, AOC, OPR3) en JA-responsieve genen (figuur 3A; zie ook aanvullende bestanden 2, 3 en 4).

Het algemene perspectief dat uit de bovenstaande informatie naar voren komt, is dat korrelamarant een divers arsenaal aan genen bezit om weerstand te bieden tegen pathogene infectie en insectenherbivoren, waarvan de meeste voor het eerst bij deze soort zijn gerapporteerd. Deze omvatten genen die mogelijk betrokken zijn bij de oxalaat- en fytoecdysteroïd-synthese (resultaten niet aangetoond), waarvan wordt aangenomen dat het effectieve verdedigingswapens zijn in amarant en andere soorten. De implementatie van een relatief robuuste verdedigingsreactie was enigszins onverwacht, althans tegen insectenherbivoren, gezien de ongewoon hoge tolerantie voor ontbossing die we bij A. hypochondriacus planten hebben waargenomen (zie hieronder), zou men kunnen verwachten dat deze soort geen investering hoeft te doen in metabolisch kostbare induceerbare verdedigingsreacties (b.v. proteaseremmers en lectines). De aard van de geïsoleerde pathogeen-resistente genen was ook complex, en omvatte een heel gamma van bacteriële en schimmel-elicitor-geïnduceerde en pathogenese-gerelateerde eiwitten, extracellulaire receptoren vergelijkbaar met die betrokken bij elicitor-geïnduceerde verdedigingsreacties, proteasen, transcriptiefactoren (TF’s) en enzymen betrokken bij reactieve zuurstofsoorten generatie-detoxificatie.

Ook belangrijk vanuit ons perspectief waren genen die mogelijk betrokken zijn bij compenserende fotosynthese, koolhydraat re-lokalisatie (tabel 2) en regulering/synthese van fytohormoon niveaus (figuur 3B), mogelijk gerelateerd aan de toegenomen vertakking waargenomen in graan amarant planten als een reactie op ontbladering veroorzaakt door insect herbivoor en / of mechanische schade . Veel van de geïdentificeerde genen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van niet-gerelateerde processen. Zo wordt de analyse van fytohormoon-gerelateerde genen, in combinatie met genen die homologie vertonen met bloei-genen, voortgezet om inzicht te krijgen in de genetische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de verschillende symptomen die worden veroorzaakt door fytoplasma-infectie van graanamarant in het veld, waaronder fyllody .

Transcriptoom vergelijking tussen A. hypochondriacus en A. tuberculatus

De publiek beschikbare ruwe transcriptomische 454 pyro-sequencing gegevens gegenereerd voor A. tuberculatus werden opnieuw geassembleerd met behulp van dezelfde computationele methoden als voor A. hypochondriacus. In onze handen leverde de assemblage echter een verhouding van contigs/singletons (12.216/53.803) op die verschilde van die welke door de vroegere werkers werd gerapporteerd (22.035/22.434), wellicht als gevolg van het gebruik van verschillende assemblers. De discrepantie deed zich voor ondanks het feit dat 83% van de totale A. tuberculatus ruwe leest die het proces inging werd geassembleerd. BLASTN alignment van de resulterende 12.216 A. tuberculatus contigs met de 21.207 A. hypochondriacus isotigs/contigs leverde 8.260 homologe sequenties op (E ≤ 1 × 10-10 en ≥ 90% identiteit). Het aantal contigs van elke soort dat significante hits (E ≤ 1 × 10-10) opleverde bij bevraging van de Uniref 100 en Amaranthaceae ESTs databanken, wordt getoond in Tabel 3. Het gecombineerde gebruik van bovenstaande informatie leidde tot de kwantificering van het aantal homologe contigs die dezelfde treffer opleveren, verschillende treffers, één treffer voor de ene soort en geen enkele voor de andere, en vice versa, en geen treffer. De verkregen resultaten zijn weergegeven in tabel 4. Uit de analyse van de homologe transcripten die met de EST-databank van de Amaranthaceae geannoteerd zijn, bleek dat de meerderheid een onbekende functie/provenantie had (21%). Het hoogste aandeel (71%) werd gevonden in EST-bibliotheken die gegenereerd werden uit onvolgroeide zaad- en bloemweefsels in Chenopodium quinoa, bloeiwijzen, kiemweefsel, wortels in verschillende ontwikkelingsstadia, hypocotylen, zaadstengels en zaadlobben van bietenwortel en chlorenchyma cellen van de niet-Kranz C4 soort Bienertia sinuspersici. Stressgerelateerde genen vormden de kleinste fractie (8%), meestal vertegenwoordigd door EST’s gegenereerd uit halofyten met zoutstress (Salicornia brachiata, Suaeda salsa, S. maritima, Atriplex centralasiatica en C. glaucum, naast EST’s uit onvolgroeid weefsel van Salsola tragus. Alle biotische-stress-gerelateerde transcripten die geïdentificeerd werden, waren afkomstig van cDNA-bibliotheken van bietwortels die blootgesteld werden aan madenvoeding (Tetanops myopaeformis). Anderzijds had tweederde van de homologe transcripten die met de Uniref100 databank geannoteerd waren een onbekende functie. Bij de daaropvolgende classificatie van transcripten (33%) met een toegewezen functie in de categorie biologische processen werd de meerderheid daarvan (16%) ingedeeld in een groep die bestaat uit basale huishoudfuncties (b.v. organisatie en biogenese van celcomponenten, celcyclus, celdood, regulering van genexpressie, translatie, cellulaire homeostase, morfogenese en groei van anatomische structuren, koolhydraat-, eiwit- en DNA-metabole processen, transport en fotosynthese), primair en secundair metabolisme (7%), signaaltransductie en transcriptieregulatie (4%). De rest omvatte transcripten die tot expressie komen als reactie op biotische (2%) en abiotische stress (4%). De meeste van deze laatste werden geïsoleerd uit Amaranthaceae en verwante halofyten die meestal aan zoutstress worden blootgesteld, Interessante (a)biotische stress-gerelateerde genen die in beide soorten aanwezig zijn, omvatten een plastid-lipide geassocieerd eiwit waarvan bekend is dat het in reactie op meerdere stresssoorten in veel plantensoorten wordt geïnduceerd, AtPOB1, een BTB/POZ-domein-eiwit dat ziektereacties in Arabidopsis en tabak positief blijkt te reguleren, het floemsap-eiwit AtPP2-A1 waarvan over-expressie in Arabidopsis sterk de floemvoeding van de groene perzikluis Myzus persicae onderdrukt, een transcript dat lijkt op het niet-specifieke lipidetransfer-eiwit type 2 van Tamarix hispida, waarvan de expressie onderdeel bleek te zijn van een adaptieve reactie op abiotische stress bij deze soort, polyamine-oxidase, een H2O2-producerend enzym dat vermoedelijk betrokken is bij celwanddifferentiatieprocessen en afweerreacties, en dat onlangs nodig bleek te zijn voor wondgenezing bij maïs methioninesulfoxidereductase, dat actief blijkt te zijn bij de verdediging tegen pathogenen in peperplanten, via de regulering van de redoxstatus van de cel, en het DEAD-box ATP-afhankelijk RNA helicase 7, een type DNA-reparatie-eiwit waarvan onlangs is aangetoond dat het multistressresistentie verleent wanneer het tot expressie komt in planten. Opmerkelijk was ook de identificatie van diverse genen die verband houden met de homeostase en tolerantie voor zware metaalionen, kationontgifting, watertransport en stressgerelateerde biosynthese van fytohormonen (bv. abscisinezuur en JA) en signaaltransductie (zie extra bestand 5).

Het aantal geannoteerde transcripten dat slechts in één soort werd gedetecteerd, was relatief groot (tabel 5). Een illustratief voorbeeld van de waargenomen verschillen tussen de transcriptomen van onkruid- en graanamarant wordt gegeven door de analyse van herbicide-doelwitgenen die werden geannoteerd met de UniRef 100 en Amaranthaceae ESTs databases. Hieruit bleek dat 29 hiervan in beide soorten werden aangetroffen, terwijl 13 en 8 sequenties alleen in A. hypochondriacus en A. tuberculatus werden aangetroffen, respectievelijk (tabel 6).

De tamelijk stringente parameters die voor de transcriptoomvergelijking zijn gebruikt, kunnen hebben geleid tot de hier waargenomen transcriptoomverschillen, hoewel het gebruik van lagere E-waardedrempels (zeg E ≤ 1 × 10-5) wellicht niet veel heeft bijgedragen tot een hoger niveau van transcriptogehomologie, zoals gesuggereerd door een eerdere genoomsequencingstudie bij Eucalyptus grandis. Een andere, meer plausibele mogelijke verklaring is dat de bovengenoemde discrepanties het gevolg zijn van fundamentele verschillen in de algemene experimentele opzet die gebruikt werd om beide transcriptomische gegevens te genereren. Bijvoorbeeld, vele biotische stress-gerelateerde genen die gedetecteerd werden in A. hypochondriacus waren afwezig in A. tuberculatus (resultaten niet getoond). Een alternatieve hypothese die voorstelt dat het waargenomen verschil te wijten is aan een belangrijke sequentie divergentie opgetreden tijdens speciatie/domesticatie zal veel verder onderzoek vereisen om gevalideerd te worden.

Digital expression profiling

Stress-responsive transcriptional profile in leaves

Deze techniek, ook bekend als tag sampling of RNA-seq, wordt beschouwd als een efficiënte methode voor genexpressie analyse. De digitale expressie profilering analyse uitgevoerd voor A. hypochondriacus geïdentificeerd een totaal van 1.971 differentieel tot expressie gebrachte genen in reactie op ten minste een van de vier stress behandelingen getest (d.w.z. water stress, zout stress, insect herbivory en bacteriële infectie) (Additional file 6). Vijftig verschillende genexpressieprofielen werden gegenereerd om de invloed van een bepaalde stressbehandeling op de expressieniveaus van een bepaald gen te bepalen. De resultaten worden getoond in figuur 4. Een duidelijk kenmerk van deze analyse was het hoge percentage niet-geannoteerde genen of genen met onbekende functie die door stress werden geïnduceerd. Deze vertegenwoordigen een potentieel rijke bron van genetisch materiaal dat systematisch zou kunnen worden geanalyseerd voor de ontdekking van genen die betrokken zijn bij nieuwe mechanismen van stressresistentie.

Alle stress-induceerbare genen met bekende functie die werden geïdentificeerd in 41 van de 50 genexpressie categorieën werden ook getabelleerd (Additional file 7). Deze omvatten verschillende TFs waarvan bekend is dat ze regulatoren zijn van stressresponsen in andere plantensoorten, b.v. AREB-achtig eiwit, Dof-type zinkvingerdomein-bevattend eiwit, BTB/POZ-domein-bevattend eiwit, GRF zinkvinger bevattend eiwit, RAP 2.4-achtig eiwit, JAZ1-repressor, ATEBP/ERF72/RAP2.3 (verwant met AP2-3) , RAV , MYB-achtige transcriptiefactor , TINY-achtig eiwit 2 , Cys2/His2 zinkvingertranscriptiefactor , de weinig bekende GAGA-motief bindende transcriptie-activator ; SCOF-1 zinkvingereiwitten, die bij Arabidopsis en andere planten door koude of zoutstress worden geïnduceerd, kennelijk om de ABRE-afhankelijke genexpressie te versterken , een vermoedelijke NAC-transcriptiefactor , en histon-fold/TFIID-TAF/NF-Y . Andere zijn geïdentificeerd in verschillende xerofyten/halofyten als mogelijke factoren die bijdragen tot hun vermogen om extreme habitats te koloniseren, bv. lycopeen synthase water kanaal proteïnen , myo-inositol-1-fosfaat synthase, cystathionine gamma-synthase fosfoenolpyruvaat carboxylase , Na+/H+ antiporter , protein phosphatase-2C , Ca2+/H+ antiporter , calcineurine B-like protein , inositol monophosphatase , en zout-geïnduceerde hydrofiele proteïne .

Niet verrassend, werden talrijke transcripten die coderen voor reactieve zuurstofvangers sterk geïnduceerd gevonden, velen van hen door meervoudige stress, b.v. superoxide dismutase, glutathione S-transferase Z1, germin-achtig oxidase en verscheidene catalases, peroxidases en ascorbaat peroxidases. Ook de sterke en meervoudige-stressinductie van aspartylprotease, diverse cysteïneproteasen, een subtilisine-achtig protease en een vacuolair verwerkingsenzym (VPE) ondersteunt een rol voor eiwit-recyclageprocessen in reactie op stress, vergelijkbaar met wat werd gevonden tijdens het proces van aanpassing aan zoutstress bij het extremofiel T. halophila, terwijl de expressie van expansines, xyloglucan endotransglycosylases, verschillende cellulose synthase subeenheden, glycine-, proline- en hydroxyproline-rijke eiwitten wordt ondersteund door het waargenomen vermogen om de celwandeigenschappen aan te passen in veel planten die stress ondergaan. Veel van deze koolhydraat-actieve genen kwamen ook sterk tot expressie in de stengels (zie hieronder).

Van bijzonder belang waren genen die sterk tot expressie kwamen bij verschillende stressbehandelingen, niet eerder gerapporteerd in amarant of verwante halofylen/extremofylen. Deze hebben duidelijk potentiële biotechnologische toepassingen en zouden ook kunnen bijdragen tot de opheldering van moleculaire mechanismen die leiden tot resistentie tegen meerdere stressomstandigheden. Een selectie omvat het volgende: Drm3, vereist voor de novo DNA-methylering in Arabidopsis thaliana, waarvan wordt voorgesteld dat het gen-silceringsprocessen reguleert ; Enhancer of SOS 3- 1, dat codeert voor een chloroplast-gelokaliseerd eiwit dat interageert met de kritische SOS3- en SOS2-regelaars van zoutstresstolerantie in Arabidopsis; YCF3- en HCF101 (hoge chlorofylfluorescentie 101)-eiwitten die essentieel worden geacht voor de assemblage en accumulatie van het fotosysteem I (PSI)-complex en het voorkomen van foto-oxidatieve schade ; de translatorische initiatiefactor eIF1, die bepalend is gebleken voor de natriumtolerantie bij gist en planten, hetgeen impliceert dat translatie een doelwit is voor zoutvergiftiging en dat het herstel ervan een cruciaal mechanisme zou kunnen zijn voor celoverleving onder NaCl-stressomstandigheden, naast de voorgestelde regulering van de ionenaccumulatie en de intracellulaire redoxstatus ; ATP-afhankelijk FtsH- protease 9, betrokken bij de afbraak van het D1-eiwit van foto- beschadigde (PSII), een stap die nodig is om de accumulatie van excessieve niveaus van reactieve zuurstofspecies te voorkomen ; de ACD1-LIKE elektronendrager, die lijkt op het genproduct voor versnelde celdood van Arabidopsis, betrokken bij de oxygenatie van feophorbide a, dat nodig is om fotooxidatieve vernietiging van de cel te voorkomen en die ook verhoogd blijkt te zijn tijdens het aanpassingsproces aan zoutstress in T. halophila; het prohibitine-gen PHB1, waarvan familieleden zich blijken te accumuleren als reactie op verschillende stressomstandigheden in vele planten, vermoedelijk om te fungeren als beschermers van de mitochondriale functie en integriteit, triggers voor de retrograde mitochondrion-nucleus signalering en/of bemiddelaars van de wisselwerking tussen H2O2 en NO, door middel van een nog niet nader omschreven mechanisme ; het Yellow Stripe Like 6-eiwit, waarvan wordt verondersteld dat de leden bijdragen tot de afgifte van metaal-micronutriënten aan en van vasculaire weefsels en tot metaaltolerantie en -hyperaccumulatie ; een vermoedelijk linker histon H1-variant-eiwit, dat tot expressie komt onder invloed van droogtestress in tomaat en dat volgens een ander mechanisme dan chromatineorganisatie een negatieve regulering van de huidmondjesgeleiding inhoudt ; GASA-1/LtCOR1-like, een gibberelline-gereguleerd eiwit dat vermoedelijk betrokken is bij de regulering van de rijping van vruchten of het tot stand komen van de slapende toestand in cambiale meristemen van bomen ; bèta- en gamma-tubulineketens, waarvan de expressie samenvalt met de steeds belangrijker wordende rol van het cytoskelet bij de bemiddeling van de respons van de plantencel op stress ; translatie-initiatiefactor 5A, waarvan is vastgesteld dat het betrokken is bij een kennelijk isovorm-afhankelijke regulering van stressresponsroutes en resistentie via een grotendeels onbekend mechanisme ; argonaute 4-achtig gen, het voornaamste eiwit dat betrokken is bij de methylering van heterochromatine en dat onlangs is erkend als een kritische factor voor door kleine RNA’s gemedieerde systemische signalering die vereist is voor de (a)biotische stressrespons van planten en het gebrek aan voedingsstoffen ; een vermoedelijk arginase, dat de rol benadrukt van arginine als precursor voor de biosynthese van polyaminen en stikstofmonoxide, die worden gebruikt als boodschappers voor de aanpassing van planten aan stress, en het porievormend toxineachtig lectine-eiwit Hfr-2, dat wordt erkend als een belangrijke biotische resistentiefactor in tarwe tegen aantasting door de Hessische vlieg en schimmelinfectie (Puccinia striiformis), en dat betrokken is bij de vegetatieve faseverandering in maïs, maar waarvan geen functie bekend is voor de regulering van abiotische stress. De functionele karakterisering van een selecte set van multi-stress-induceerbare A. hypochondriacus genen, in Arabidopsis, tabak en/of graanamaranth, is nu aan de gang in ons laboratorium.

Transcriptioneel profiel in stengels

Vergelijking van de stengel-afgeleide cDNA bibliotheek (S6) met die gegenereerd uit bladeren onderworpen aan biotische en abiotische stress (S2 tot S5) liet toe om een kleine groep van transcripten te identificeren waarvan de expressie uitsluitend werd gedetecteerd in stengels. Opmerkelijk was dat de accumulatie van verscheidene andere transcripten hoger was in stengels dan in bladweefsel van amarantplanten blootgesteld aan (a)biotische stress (zie aanvullend bestand 8). Het waargenomen transcript profiel was consistent met eerder gerapporteerde gegevens voor stam transcriptomic analyses in Arabidopsis thaliana. Alle geannoteerde transcripten werden geclassificeerd in verschillende categorieën, vergelijkbaar met de bovenstaande studies.

Lignine en cuticule wax biosynthese werd vertegenwoordigd door genen die coderen voor eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij monolignol biosynthese (bijv. cytochroom P450-reductases, nodig voor de activiteit van verscheidene belangrijke cytochroom P450-enzymen van de fenylpropanoïdenroute ), monolignoltransport (bijv. ABC-transporters ) en cuticulaire lipidenexport (bijv. wit-bruin-complex ABC-transporterfamilie ). Het bescheiden aantal geüpreguleerde genen voor de biosynthese van lignine dat werd waargenomen, hield waarschijnlijk verband met het gebruik van jonge amarantplanten, die nog geen actieve lignificatie ondergingen, voor experimenten.

De categorie koolhydraat-actieve enzymen was sterk vertegenwoordigd. Dit was niet verwonderlijk, aangezien deze eiwitten een fundamentele rol spelen in de biosynthese en modificatie van de celwand en derhalve tijdens de ontwikkeling van de stengel sterk gereguleerd worden. Zij omvatte een aantal glycosyltransferasen en verscheidene glycosylhydrolasen (GH) die families vertegenwoordigen met cellulase (GH9), β-1,3-glucanase (GH3), xylanase (GH10), xyloglucan endotransglucosylase-hydrolase (GH16), glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (GH17), invertase (GH31) en β-D-galactosidase (GH35) activiteit. Deze enzymen zijn op verschillende manieren nodig voor het losmaken en strekken van de celwand, de vorming van de secundaire celwanden van vaatweefsels, hydrolyse van de xylan ruggengraat, post-translationele modificaties (zoals glycosyleringen) van eiwitten en het mobiliseren van energie in de vorm van sucrose. Ook werden pectine-methylesterases (PME) gedetecteerd die betrokken zijn bij de wijziging van de fysische, chemische en biologische eigenschappen van pectines. De gelijktijdige expressie van een PME-remmer betekende waarschijnlijk een noodzaak om PME in jonge amarantstelen te reguleren om de met PME-activiteit geassocieerde wandverstijving te vermijden. Bovendien werd een vermoedelijk β-expansine-eiwit gedetecteerd; deze eiwitten moduleren de interactie tussen hemi-celluloses en cellulose, vermoedelijk via een verstoring van hun gedeelde waterstofbruggen.

In de extracellulaire oxido-reductases groep werden twee peroxidases gevonden, die respectievelijk tot de peroxidase 25 en 64 families behoren. Peroxidasen blijken in matige tot hoge mate tot expressie te komen in zich ontwikkelende stengels, waar zij verondersteld worden de rekbaarheid van de celwand te verminderen door hun rol bij de vorming van covalente verbindingen tussen pectineresiduen, hydroxyproline-rijke eiwitten zoals extensines, en lignine-precursors. Eén gen dat codeert voor een multikoper-oxidase van de SKS-familie (SKS5) werd geïdentificeerd. De functie van deze eiwitten in de stamontwikkeling is niet goed bekend, hoewel de expressie van SKS5 onlangs verhoogd bleek te zijn in metaalhyperaccumulerende ecotypes van Thlaspi caerulescens. Een ander oxido-reductase dat in amarantstelen werd geïdentificeerd, was een 2-OG-Fe(II) oxygenase-eiwit met onbekende functie dat onlangs in verband werd gebracht met verdedigingsmechanismen tegen schimmelinfectie in Arabidopsis.

Er werden verschillende genen geïdentificeerd die coderen voor eiwitten met vermeende interactiedomeinen met polysacchariden en/of andere eiwitten. Veel van de in deze categorie ingedeelde genen zijn kinasen, peptidereceptoren en receptorachtige kinasen die ontwikkelingsprocessen in planten reguleren, zoals de CLAVATA1-achtige receptor , CLAVATA3/ESR-gerelateerde receptor , Abnormal Leaf Shape 2 receptorachtig kinase , leucinerijke repeat receptorachtig kinase RLK7 en LRR XI-23 kinase . Een aantal hydroxiproline-rijke (glyco)proteïnen, die hoogstwaarschijnlijk arabinogalactaan-eiwitten (AGP’s) vertegenwoordigen, structurele proteïnen (b.v. extensines, proline-rijke proteïnen, PRP’s) en een verwant prolyl-4-hydroxylase (katalytische alpha-2-subeenheid) dat nodig is voor de hydroxylering van proline-residuen , kwamen ook in hoge mate tot expressie in de stengels. Er zijn talrijke rollen voor AGP’s in de ontwikkeling van planten gesuggereerd door hun invloed op de bepaling van het lot van de cellen, somatische embryogenese en celproliferatie. Ook is aangenomen dat AGP’s signaalmoleculen zijn en zich associëren met pectische polysacchariden, terwijl is aangetoond dat extensinen, PRP’s en andere (b.v. glycinerijke eiwitten) tot expressie komen in specifieke celtypen, waaronder xyleem- en floëemweefsels.

Ook aanwezig waren genen die codeerden voor een Rhomboid-like 2 endopeptidase, en twee eiwitten met inhibitor activiteit: een lipid transfer protein/trypsine-alfa amylase inhibitor en een cysteine proteinase inhibitor. Bovendien werden transcripten voor een F-Box eiwit (SKIP2) en een 26S proteasoom niet-ATPase regulerende subeenheid, waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij de doelgerichte afbraak van eiwitten die in gang wordt gezet als reactie op verschillende stimuli tijdens de groei en/of diverse stressomstandigheden, ook gedetecteerd. Er is gesuggereerd dat protease-activiteit en de modulatie daarvan door proteaseremmers noodzakelijk is voor de verwerking en/of omzet van celwandproteïnen, het genereren van peptidesignalen, geprogrammeerde celdood en/of het in evenwicht brengen van celexpansie/proliferatiesnelheden, die collectief vereist zijn voor een goede stamontwikkeling.

Tot de categorie diverse eiwitten behoorden genen die coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij het vetmetabolisme (GDSL-lipasen en een vermoedelijk glycerofosforyldiester-fosfodiesterase), waarvan wordt gesuggereerd dat ze belangrijk zijn voor de ontwikkeling van stengels, een koperbindend plantacyanine (ARPN), waarvan wordt aangenomen dat het oxidoreductieprocessen in celwanden reguleert, diverse eiwitten waarvan bekend is dat ze nodig zijn voor het behoud van stengelcellen in het apicale meristeem van spruiten (histon H2A; Aurora 2 histon kinase), metaaltolerantie (bijv.b.v. selenocysteine methyltransferase ) en componenten van het cytoskelet, die hoogstwaarschijnlijk betrokken zijn bij celdeling en -strekking. De vondst van een transcript dat codeert voor de katalytische LigB-subeenheid van een aromatische ring-opening dioxygenase-familie (d.w.z. een vermoedelijk dopa-dioxygenase), het prominente enzym in de betacyanine-biosynthese, en van biosynthetisch verwante glycosyl-transferases (GT’s) (b.v. GT van Phytolacca Americana en een UDP-GT) was consistent met het sterk gepigmenteerde fenotype van het stengelweefsel dat werd gebruikt voor het genereren van de gesequencieerde cDNA-bibliotheek. De bepaling van de structuur en regulatie van pigment-gerelateerde genen, hun weefsel- en stress-gerelateerde expressiepatronen, en hun waarschijnlijke rol in de verdediging tegen insecten-herbivoren in graanamaranth wordt nu actief voortgezet in ons laboratorium. Verschillende TFs werden ook gedetecteerd. In overeenstemming met een vorig rapport behoorden de meeste TF’s die in hoge mate tot expressie kwamen in stengelweefsel van graanamarant tot de families van MYB, AP2-EREBP, GRAS, bHLH-domain en homeodomain (bv. WOX4 ). TF’s in stengels zijn op verschillende manieren in verband gebracht met de regulering van de biogenese en differentiatie van vasculaire weefsels, de expressie van fenylpropanoïde genen en de ontwikkeling van vezels. Tenslotte werd een hoog expressieniveau gevonden voor verscheidene abiotische stress- en defensiegerelateerde genen in de stengels van A. hypochondriacus. De aanwezigheid van sterk geëxpresseerde defensie-gerelateerde genen was in overeenstemming met een recent rapport dat aantoonde dat genen betrokken bij plantenverdediging en beschermende functies dominant waren in zich ontwikkelende stengels van Populus trichocarpa. In dit verband pleit de gelijktijdige aanwezigheid van een vermoedelijk jasmonaat-o-methyltransferase en een CXE-carboxylesterasegen dat codeert voor een eiwit dat vermoedelijk methyljasmonaat (MeJA) als substraat kan identificeren (naast methylsalicylaat en indol-3-acetaat) in Actinidia arguta, voor een mogelijke rol van MeJA in de signalering, zowel binnen als tussen amarantplanten, tijdens biotische en/of abiotische stress . Andere interessante genen die in amarantstelen zijn geïdentificeerd en waaraan onlangs een actieve rol in de verdediging tegen pathogenen is toegeschreven, zijn onder meer die welke coderen voor respectievelijk epoxidehydrolase 2 en VPE-1B. De rol van epoxidehydrolase in de verdediging wordt in verband gebracht met zijn betrokkenheid bij de detoxificatie, signalering en/of metabolisme van antimicrobiële verbindingen, terwijl het belang van VPE wordt toegeschreven aan zijn betrokkenheid bij door elicitor veroorzaakte immuniteit die samenhangt met de gecombineerde inductie van een overgevoeligheidsreactie (HR) en sluiting van de huidmondjes. Zoals hierboven vermeld, is de expressie van VPE ook in verband gebracht met reacties op abiotische stress.