Variaties in de Calvin-Benson cyclus: selectiedruk en optimalisatie?

De Calvin-Benson cyclus vormt de basis van de koolstoffixatie in alle fotosynthetische organismen. Er is echter relatief weinig bekend over de mate waarin de werking varieert tussen soorten. Met behulp van een metabolietenprofiel ontdekten we verschillen in het niveau van de belangrijkste tussenproducten van de Calvin-Benson cyclus tussen C3 en C4 soorten. Deze verschillen in metabolietenpools werden waargenomen tussen C3-soorten en tussen C3- en C4-planten. Dit werk doet de interessante mogelijkheid rijzen dat verschillende selectiedrukken op componenten van de Calvin-Benson cyclus hebben geleid tot de onafhankelijke optimalisatie ervan tussen soorten.

In 1954 publiceerden Melvin Calvin, Andrew Benson en James Bassham de metabolische route die wordt gebruikt om atmosferisch CO2 vast te leggen – de Calvin-Benson cyclus (Bassham et al., 1954). Hun fundamentele ontdekkingen waren gebaseerd op het voeden van de alg Chlorella met 14C-gelabeld CO2 en het traceren van de labeling van metabolieten in de tijd (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). Zij ontdekten dat de cyclus uit drie fasen bestaat: eerst fixeert het enzym ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase/oxygenase (Rubisco) CO2 met ribulose-1,5-bisfosfaat (RuBP) als acceptor, waarbij twee 3-koolstofmoleculen worden geproduceerd, 3-fosfoglyceraat (3-PGA). Ten tweede worden ATP en NADPH, gegenereerd tijdens de fotosynthetische elektronentransportketen (de lichtafhankelijke reacties van de fotosynthese), gebruikt om 3-PGA te fosforyleren en vervolgens te reduceren tot triosefosfaat (triose-P). Ten derde wordt de CO2-acceptor RuBP geregenereerd via een reeks reacties (kader 1). De meeste enzymen die bij deze cyclus betrokken zijn, zijn eerder of kort daarna ontdekt (Horecker et al., 1951; Racker et al., 1953; Mayoudan et al., 1957). Sindsdien wordt algemeen aangenomen dat de werking van de Calvin-Benson-cyclus sterk geconserveerd is bij verschillende plantensoorten.

Kader 1.

De Calvin-Benson-cyclus

De Calvin-Benson-cyclus is opgebouwd uit drie fasen: (1) koolstoffixatie, (2) reductie en (3) regeneratie van de CO2-acceptor.

Carboxylatie wordt bereikt via ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase/oxygenase (Rubisco), dat CO2 fixeert met ribulose-1,5-bisfosfaat (RuBP) als acceptor en daarbij twee 3-koolstofmoleculen 3-fosfoglyceraat (3-PGA) produceert. 3-PGA wordt vervolgens gefosforyleerd door fosfoglyceraat kinase (PGK) en gereduceerd tot triosefosfaat (triose-P) door glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) in de reductiefase. De cyclus gebruikt 3 ATP en 2 NADPH per molecuul gefixeerd CO2. Triose-P kan uit de chloroplast worden getransporteerd om sucrose te produceren in het cytosol. Fructose 1,6-bisfosfaat aldolase (FBP ald) kan triose-P omzetten in fructose-6-fosfaat (F6P), het intermediair dat wordt gebruikt om zetmeel te produceren. Ook kan triose-P worden omgezet in RuBP in een reeks regeneratiereacties om meer CO2-moleculen vast te leggen.

Afkortingen: fructose-1,6-bisfosfaat (FBP), fructose-1,6-bisfosfatase (FBPase), erythrose-4-fosfaat (E4P), sedoheptulose-1,7-bisfosfaat aldolase (SBP ald), sedoheptulose-1,7-bisfosfaat (SBP), sedoheptulose-1,7-bisfosfatase (SBPase), sedoheptulose-7-fosfaat (S7P), transketolase (TK), ribose-5-fosfaat (R5P), xylulose-5-fosfaat (Xu5P), ribose-5-fosfaatisomerase (RPI), ribulose-5-fosfaat epimerase (RPE), ribulose-5-fosfaat (Ru5P), fosforibulokinase (PRK). Enzymen die onomkeerbare reacties katalyseren zijn aangegeven met een dikke vette pijl (d.w.z. Rubisco, FBPase, SBPase en PRK).

In de overgrote meerderheid van landplanten wordt de Calvin-Benson-cyclus, samen met de lichtafhankelijke reacties van de fotosynthese, hoofdzakelijk uitgevoerd in de mesofylcellen van de bladeren. Rubisco discrimineert echter slecht tussen CO2 en O2 (Bowes et al., 1971) en het fixeren van een O2-molecuul in plaats van CO2 resulteert in fotorespiratie – een energetisch dure salvage pathway om RuBP terug te winnen. Nadat de atmosferische CO2-concentratie 2,3 miljard jaar geleden drastisch daalde (Bekker et al., 2004), ontwikkelden zich twee koolstof-concentratiemechanismen, waardoor de hoeveelheid fotorespiratie werd beperkt. Deze modificaties van het basisfotosyntheseproces, C4-fotosynthese en Crassulaceenzuurmetabolisme (CAM), ontstonden elk meerdere keren (Sage et al., 2011). Bij C4-fotosynthese is er sprake van een ruimtelijke scheiding van de fotosynthese, zodat de componenten van zowel de lichtafhankelijke reacties als de Calvin-Bensoncyclus in de mesofyl- en bundelschedecellen plaatsvinden (kader 2). Ondanks de verschillen in anatomische locatie van de koolstoffixatie was tot nu toe weinig bekend over hoe de werking van de Calvin-Benson-cyclus kan verschillen in C4- versus C3-planten en ook tussen C3-planten onderling.

Kader 2.

Het koolstof-concentratiemechanisme in C4-planten

In 1966 ontdekten Hal Hatch en Roger Slack de C4-fotosynthese (Hatch en Slack, 1966), waarbij een koolstof-concentratiemechanisme wordt toegevoegd aan de gewone koolstof-C3-fixatieroute. Zij gebruikten 14C-labelling om aan te tonen dat CO2 in suikerrietbladeren eerst werd vastgelegd in een zuur met 4 koolstofverbindingen, in plaats van in 3-fosfoglyceraat (3-PGA) zoals in C3-planten. C4-planten gebruiken fosfoenolpyruvaat carboxylase (PEPC) als hun eerste koolstoffixerend enzym in de mesofylcellen. Het in de mesofylcellen geproduceerde 4-koolstofzuur (malaat of aspartaat, afhankelijk van het type C4-fotosynthese) komt vervolgens in de bundelschedecellen terecht, waar het wordt gedecarboxyleerd en CO2 vrijkomt. Door dit mechanisme van koolstofconcentratie kan Rubisco tijdens de Calvin-Benson-cyclus in de bundelschedecellen bijna uitsluitend als carboxylase fungeren. Naast een herconfiguratie van bestaande metabolische enzymen vereist de C4-route de ontwikkeling van een gespecialiseerde bladanatomie (Kranz-anatomie), die een grotere afstand tussen de nerven en een grotere omvang van de bundelschedecellen omvat. Klassiek worden drie verschillende types van C4-fotosynthese onderscheiden, genoemd naar het primaire enzym dat verantwoordelijk is voor de decarboxyleringsreactie in de bundelschedecellen: NAD-ME, NADP-ME of PEPCK type. Afkortingen: koolzuuranhydrase (CA), oxaalacetaat (OA), NADP-afhankelijk malaatdehydrogenase (NADP-MDH), malaat (M), NADP-afhankelijk malatenzym (NADP-ME), pyruvaat (Pyr), pyruvaat,orthofosfaatdikinase (PPDK), fosfoenolpyruvaat (PEP).

Variatie in metabolieten van de Calvin-Benson-cyclus tussen soorten

De Calvin-Benson-cyclus is zonder twijfel een van de meest kritische biochemische routes op aarde, als de weg van koolstofassimilatie in planten – het hart van de fotosynthese. Maar verloopt deze route bij alle plantensoorten op dezelfde manier? Arrivault et al. (2019) profileerden de abundantie van metabolieten uit de Calvin-Bensoncyclus van vijf C3-planten (waaronder Arabidopsis en verschillende belangrijke gewassen zoals rijst, tarwe en cassave) en vier C4-planten (waaronder maïs). Totale metabolieten werden geëxtraheerd uit rijpe bladeren en gemeten met omgekeerde-fase vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Voor betrouwbare kwantificering werden de monsters verrijkt met isotoop-gelabelde interne metabolietstandaarden; 3-PGA werd enzymatisch gekwantificeerd. Metabolietprofielen van de verschillende plantensoorten werden vergeleken met behulp van principale componentenanalyse.

Opvallend genoeg ontdekten Arrivault et al. (2019) aanzienlijke verschillen in de metabolietprofielen van tussenproducten van de Calvin-Bensoncyclus tussen de vijf C3-soorten die zij bestudeerden. Tussenproducten die het meest varieerden waren onder andere de absolute niveaus van 3-PGA, triose-P, ribulose-5-fosfaat (Ru5P) en xylulose-5-fosfaat (Xu5P). De relatieve niveaus van RuBP vergeleken met de niveaus van de tussenproducten die betrokken zijn bij de regeneratie van RuBP waren variabel tussen de soorten. Bovendien toonden de auteurs variabiliteit aan in de relatieve niveaus van metabolietparen zoals fructose-1,6-bisfosfaat (FBP) en fructose-6-fosfaat (F6P), die gekoppeld zijn via de irreversibele reactie van FBPase; en in het metabolietpaar sedoheptulose-1,7-bisfosfaat (SBP) en sedoheptulose-7-fosfaat (S7P), die irreversibel onderling worden omgezet door SBPase. In de meeste gevallen scheidden de vijf C3-soorten zich duidelijk van elkaar in de principale componentenanalyse. De mate waarin zij zich van elkaar onderscheidden, hing af van de vraag of de gegevens werden genormaliseerd naar versgewicht, chlorofylgehalte of eiwitgehalte. De variatie in deze tussenproducten binnen de vijf C3-soorten wijst op verschillen in de manier waarop planten dezelfde koolstofbindingsroute uitvoeren. Deze informatie heeft gevolgen voor strategieën om de fotosynthese te verbeteren. Zo kan SBPase de snelheid van de fotosynthese beperken (Zhu et al., 2007) en kan overexpressie de fotosynthese-efficiëntie verhogen (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Het veranderen van de activiteit van een enkel enzym in de Calvin-Benson cyclus kan dus invloed hebben op de fotosynthesesnelheid, en vervolgens op de biomassa en de opbrengst. Het is echter bekend dat de doeltreffendheid van deze aanpak verschilt van soort tot soort. De reeds bestaande variatie in niveaus van de SBP- en S7P-metabolieten tussen C3-soorten gerapporteerd door Arrivault et al. (2019) is daarom belangrijk en kan inzicht verschaffen in de variabele respons van de fotosynthese op het verhogen van de hoeveelheden SBPase.

Aangezien het koolstof-concentratiemechanisme van C4-planten de fotorespiratie beperkt, was het misschien minder verrassend dat het eerste product van fotorespiratie, 2-fosfoglycolaat (2-PG), minder overvloedig aanwezig was in C4-soorten dan in C3-soorten. Bovendien hadden C4-planten lagere RuBP-niveaus dan C3-planten, wat overeenkomt met hun lagere investering in Rubisco. Echter, zelfs wanneer 2-PG en RuBP niveaus uit de dataset werden weggelaten, scheidden C3 en C4 metabolietniveaus bijna altijd in de principale componentenanalyse. Deze verschillen waren consistent, ongeacht of de gegevens werden genormaliseerd naar versgewicht, chlorofylgehalte of eiwitgehalte, en de veranderingen wijzen er dus op dat de enzymen die verantwoordelijk zijn voor het genereren van de metabolieten, in verschillende soorten op verschillende snelheden katalyseren. De auteurs muntten de term “werkingsmodus” van de Calvin-Benson-cyclus om deze verschillen te beschrijven – zodanig dat de cyclus verschillend functioneert tussen soorten, ook al zijn dezelfde enzymen erbij betrokken, wat leidt tot de waargenomen veranderingen in de relatieve niveaus van tussenproducten. Zij stellen daarom voor dat de verschillen in de Calvin-Benson cyclus tussen C3 en C4 planten breder zijn dan een eenvoudige ruimtelijke verplaatsing naar bundelschede cellen in de laatste, en een aanpassing inhouden in de werkingswijze van de cyclus.

Toekomstperspectieven

Het vaststellen dat de werkingswijze van de Calvin-Benson cyclus kan variëren is interessant, vooral gezien het feit dat de structuur van de route (in termen van betrokken enzymen en hun reactievolgorde binnen de cyclus) sterk geconserveerd is. In de loop van de miljoenen jaren sinds het ontstaan van de cyclus is de verhouding tussen O2 en CO2 in de atmosfeer echter drastisch veranderd. Men denkt dat deze veranderingen ertoe hebben bijgedragen dat sommige plantensoorten mechanismen voor koolstofconcentratie hebben ontwikkeld. De auteurs stellen nu voor dat lage CO2-niveaus in combinatie met specifieke milieuomstandigheden kunnen hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende werkingswijzen van de Calvin-Benson-cyclus. De waargenomen variatie in metabolietprofielen zou dus een weerspiegeling kunnen zijn van verschillende selectiedrukken op de manier waarop de Calvin-Benson-cyclus in verschillende plantenlijnen wordt gereguleerd. De door de auteurs gebruikte aanpak om de tussenproducten van de Calvin-Benson cyclus te analyseren zou nu op meer soorten kunnen worden toegepast, en dit zou bijzonder interessant zijn als deze een breder spectrum van plantenfamilies in verschillende milieus zouden bestrijken. Dit zou kunnen onthullen of de variatie strikt de fylogenetische taxa volgt of specifieke omgevingen waaraan de planten zich hebben aangepast.

Ook voeren de in Arrivault et al. geanalyseerde C4-planten alle het NADP-ME type van C4-fotosynthese uit. Een veelbelovende lijn van verdere studie zou dus zijn om te onderzoeken of vergelijkbare veranderingen in tussenproducten van de Calvin-Benson cyclus worden waargenomen in alle drie de typen van C4 metabolisme, of dat ze specifiek zijn voor het NADP-ME type.

Dit werk is een uitstekend uitgangspunt om te ontdekken hoe deze verschillende Calvin-Benson cyclus modi worden gecontroleerd op moleculair niveau. Terwijl het profileren van metabolieten een onbevooroordeelde benadering mogelijk maakt om de variatie in niveaus van tussenproducten tussen verschillende soorten te beoordelen, moeten de onderliggende oorzaken voor deze verschillen nog worden vastgesteld. De variatie tussen soorten kan het gevolg zijn van verschillen in genexpressie en de daaruit voortvloeiende eiwitactiviteiten, variatie in aminozuursequentie die van invloed is op de kinetiek, of post-translationele regulatie van de enzymen. In het bijzonder zijn bijna alle enzymen van de Calvin-Benson cyclus onderhevig aan op zijn minst enige vorm van redoxregulatie, meestal via het thioredoxine (TRX)/ferredoxine (Fd) systeem (Buchanan en Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). De integratie van deze transcript-, eiwitabundantie- en enzymactiviteitsgegevens met de metabolietniveaus kan de moleculaire basis van de variatie aan het licht brengen. Bovendien kunnen de waargenomen variaties in metabolietenpools ook verband houden met de vraag naar bepaalde tussenproducten, met name die welke aan de Calvin-Benson-cyclus worden onttrokken. Zo kan de flux door de cyclus worden beïnvloed door uittredingsroutes om de synthese van zetmeel (via F6P), sucrose en isoprenoïden (via triose-P), aminozuren via de shikimaatroute (via E4P), evenals thiamine en nucleotiden (via R5P) mogelijk te maken (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) melden interessante variatie in hoe componenten van de Calvin-Benson-cyclus werken in verschillende plantensoorten. Dit zal zeker een katalysator zijn voor verdere studies over hoe planten deze fundamentele en oude route van koolstofbinding hebben aangepast aan verschillende omgevingen.