Wilt u bloedmonsters gaan gebruiken in uw translationeel onderzoek? Misschien bent u geïnteresseerd in uitgezaaide borstkanker, of niet-kleincellige long. Of misschien hebben de uitdagingen en beperkingen van solide tumormonsters u aan het denken gezet… het is tijd.
Nu wat?
Laten we eens nader kijken naar DNA-opbrengst, en de realiteit van het werken met celvrij DNA uit plasma. Celvrij DNA (of cfDNA) verwijst naar al het niet-ingekapselde DNA in de bloedstroom. Een deel van dat celvrije DNA is afkomstig van een tumorkloon en wordt circulerend tumor-DNA (of ctDNA) genoemd. cfDNA zijn nucleïnezuurfragmenten die tijdens apoptose of necrose in de bloedbaan terechtkomen. Normaal worden deze fragmenten door macrofagen opgeruimd, maar wij denken dat de overproductie van cellen bij kanker meer van het cfDNA achterlaat. Deze fragmenten zijn gemiddeld ongeveer 170 basen lang, hebben een halfwaardetijd van ongeveer twee uur, en zijn aanwezig in zowel een vroeg als een laat ziektestadium in veel voorkomende tumoren, waaronder niet-kleincellige long en borst. Dat gezegd hebbende, cfDNA-concentratie varieert sterk en komt voor tussen 1 en 100.000 fragmenten per milliliter plasma.
Als je al een tijdje in de next-generation sequencing-ruimte bent, wil je misschien weten over gevoeligheid en specificiteit. We hebben een hoge gevoeligheid en specificiteit aangetoond voor varianten met een frequentie van meer dan één procent met 20 nanogram input-DNA, en meer dan vijf procent met 5 nanogram. Om meer te zien over hoe dat moet, bekijk onze video over cfDNA-assays. U hebt misschien gehoord over het gebruik van cfDNA voor analyses met een aantoonbaarheidsgrens van nul procent. Hoewel de technologie bestaat om .01% te bereiken (digitale druppel bijvoorbeeld), is er een biologische grens waar we het over moeten hebben.
Uit een bloedmonster van 10 ml, met behulp van de Applied Biosystems MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit, verkrijgen we routinematig ongeveer 20 nanogram cfDNA, of ongeveer 6 bruikbare moleculen voor analyse. Een snelle rekensom leert ons dat we bij 1% detectiegrens ongeveer 25 moleculen kunnen verwachten. Bij 0,1% zijn er naar verwachting slechts 2-3 moleculen aanwezig. Dat betekent dat er onder 0,1% misschien geen moleculen aanwezig zijn voor analyse. Vergeet ook niet dat cfDNA-concentraties zeer variabel zijn. Zij kunnen zeer laag zijn in kritieke stadia zoals een vroeg recidief of de ontwikkeling van resistentie, waarop veel onderzoekers zich nu richten. Om met succes 20 nanogram DNA uit bloedplasma te isoleren, zijn zowel handmatige als geautomatiseerde methoden beschikbaar, afhankelijk van uw doorvoerbehoeften.
DNA in de hand, dicteert uw onderzoek welk pad u op dit punt moet volgen. U zou kunnen kiezen voor digitale PCR voor onderzoek naar recidiefmonitoring. Voor onderzoek naar therapiekeuze kan een next-generation sequencing assay de voorkeur hebben. Waar uw vloeibaar biopsie-onderzoek u ook brengt, wij kunnen u helpen daar te komen met complete oplossingen voor cfDNA-analyse, van slechts een paar targets tot multi-gen assays.
Ik hoop dat we u een aantal dingen hebben gegeven om over na te denken als u overweegt celvrij DNA in uw laboratorium te gebruiken. Maar ik weet zeker dat u nog vragen heeft. Dus stel uw vragen op thermofisher.com/ask en abonneer u op ons kanaal om meer video’s zoals deze te zien. En onthoud, als je twijfelt, gewoon Seq It Out!