A highly polymorphic insertion in the Y-chromosome amelogenin gene can be used for the evolutionary biology, genetyki populacji i określania płci u Cetacea i Artiodactyla

Amelogenina może być wykorzystana do molekularnego określania płci i genetyki ewolucyjnej u Cetartiodactyla

Amplifikacja badanego segmentu locus amelogeniny przy użyciu gatunkowo specyficznych starterów SC1-SC2 dała oczywisty polimorfizm wielkościowy związany z płcią u wszystkich Cetacea (Fig. 1) z unikalnym pasmem 521 bp dla samic (dwie kopie Amel-X) i dodatkowym pasmem 980 bp dla Amel-Y u samców. Ten wzór był oczywisty u samców wielorybów fiszbinowych (Mysticetes), ale nie było odpowiedniej amplifikacji Amel-X u samców delfinów, chyba że przy użyciu starterów X5-X6 pochodzących z sekwencji ludzkiej amelogeniny. Poprzednie badania wykazały, że amplifikacja amelogeniny była podatna na wypadanie alleli lub przynajmniej na preferencyjną amplifikację. Zjawiska te mogą być wyjaśnione przez kilka czynników. Zazwyczaj amplifikacja mniejszego allelu jest preferowana, gdy ilość polimerazy jest czynnikiem ograniczającym lub w przypadku degradacji szablonu DNA. Małe ilości DNA mogą również zwiększać stochastyczność annealingu. Jednak nasze wyniki nie są zgodne z tymi sytuacjami, gdyż faworyzowany allel (Amel-Y) jest zawsze największy. Z drugiej strony, różnice w zawartości GC i niedopasowania w sekwencjach annealingu mogą odpowiadać za zróżnicowaną amplifikację. Badane przez nas fragmenty amelogeniny charakteryzują się większą zawartością GC w przypadku amplifikacji z chromosomu X (56%) niż z chromosomu Y (47%). Różnica ta może wynikać z braku insercji we fragmencie Amel-X. Ta cecha, jak również niedopasowanie o długości 2 bp pomiędzy Amel-X delfina a 5′ końcem primera odwrotnego SC2 (Rys. 2) może sprzyjać preferencyjnej amplifikacji kopii Y u delfinów (Rys. 1b). Rzeczywiście, amplifikacja próbek samców delfinów SC3 (primer bez niedopasowania, patrz Rys. 2) zamiast SC2, przywraca dwa pasma, widoczne u wielorybów płetwalowatych. Obecność tej dużej insercji w kopii Amel-Y może być wykorzystana do określania płci u prawdopodobnie wszystkich gatunków waleni.

W celu określenia punktów przerwania lokalizacji insercji Y i zbadania jej historii ewolucyjnej, sekwencjonowaliśmy różne walenie (wymienione w Methods; sekwencje zdeponowane pod następującymi dostępami: EMBL:AM744958 do AM744971). Po wyrównaniu z dostępnymi sekwencjami z Artiodactyla (patrz lista w Methods), wykryliśmy ten sam polimorfizm u wszystkich pozostałych Cetartiodactyla z wyjątkiem świni (Fig. 3): insercję o długości 460-465 bp (wielkość jest funkcją indeli w obrębie różnych osobników lub gatunków) zlokalizowaną pomiędzy 4. i 5. eksonem (188. do 651. pozycja sekwencji Y, np. EMBL:AM744958). Nazwy haplotypów i odpowiadające im akcesje podano w tabeli 1. Podobieństwo sekwencji sprawdzono poprzez wykonanie testu BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) nad sekwencjami kolekcji GenBank nr/nt nukleotydów z algorytmem megablast (przeznaczonym dla sekwencji o wysokim podobieństwie). Poza bydlęcym i owczym Amel-Y, jedyne dwa istotne (78 i 83% homologii, wartości E 4.10-68 i 3.10-53) trafienia pasowały do fragmentu na siódmym chromosomie u świń (ok. 250 bp), sugerując, że insercja może być elementem transpozycyjnym.

Interpretujemy obecność tej insercji jako synapomorfię (wspólny charakter) Cetartiodactyla z wyłączeniem świń i prawdopodobnie innych wczesnych grup pochodnych (wielbłądów, hipopotamów; patrz ryc. 3). Oprócz tej długiej insercji, 46 innych indeli zostało wykrytych przez wyrównanie sekwencji (pozycje i rozmiary wyszczególniono na Rysunku 5). Wcięcia są szczególnie przydatne do testowania hipotez filogenetycznych, ponieważ mogą dostarczać informacji o dawnych różnicach, a nie informacji o populacji. Dlatego ocenialiśmy, czy topologie filogenetyczne różniły się, jeśli uwzględnialiśmy lub nie informacje zawarte w tych indelach. Tak więc, sekwencje waleni podsumowane w Tabeli 1, jak również sekwencje Artiodactyla były analizowane najpierw klasycznie, z lukami zakodowanymi jako brakujące znaki, a następnie z lukami zakodowanymi jako uzupełniające znaki binarne (patrz Rys. 5). Dla każdej analizy przeprowadzono dwa niezależne poszukiwania bayesowskie. Drzewa filogenetyczne przedstawione na rycinie 4 są wynikiem konsensusu 20 000 drzew próbkowanych po tym, jak odchylenie standardowe między dwoma przebiegami spadło poniżej 0,01. Pokazują one wysoko wspierane węzły. Analiza filogenetyczna przeprowadzona na kompletnym segmencie (Rys. 4a) potwierdziła grupowanie według kopii chromosomów płciowych u Cetartiodactyla (Stenella cœruleoalba, Balænoptera physalus, Grampus griseus, Tursiops truncatus, Bos taurus i Ovis aries), podczas gdy Amel-X i Amel-Y grupowały się u innych ssaków (Homo sapiens, Sus scrofa) razem z Amel-X z Cetartiodactyla. Z drugiej strony, wnioskowanie filogenetyczne bez uwzględnienia insercji dało inny wynik (ryc. 4b): podczas gdy haplotypy grupowały się również według chromosomów u waleni, u pozostałych Cetartiodactyla nie zaobserwowano żadnego sygnału związanego ani z historią gatunku, ani z łożyskiem chromosomowym. Stąd sygnał filogenetyczny związany z historią gatunku wydaje się wzmacniać, gdy podążamy drzewem od Cetartiodactyla w kierunku naczelnych. To częściowe, homoplazmatyczne, utrzymywanie się sygnału filogenetycznego może być wyjaśnione wpływem regionu otaczającego insercję. Może to wynikać z podeszłego wieku insercji (74-87 myrs ). Późniejsza utrata homologii mogła dać początek bardziej rozbieżnej ewolucji między chromosomami u niektórych taksonów (Cetacea) niż u innych (Artiodactyla).

Interesujące byłoby zbadanie tego regionu na poziomie całego kladu poprzez połączenie sekwencji i indeli w tej samej analizie. Mogłoby to dostarczyć wskazówek do testowania wielu hipotez o bazalnej radiacji Cetartiodactyla (np. ). Biorąc pod uwagę przypuszczalnie bazalną pozycję Suioidea i Tylopoda w filogenezie Cetartiodactyla ( i Fig. 3), stawiamy hipotezę, że główne wydarzenie ewolucyjne reprezentowane przez wstawkę (zilustrowaną strzałką Figura 4a) wystąpiło raz w kladzie Cetacea-Ruminantia, a nie w pozostałych Cetartiodactyla.

Występowanie tej dużej insercji w kopii Amel-Y może być przydatne do określania płci.

Historia ewolucyjna wskazuje również, że nasza technika określania płci ma zastosowanie, oprócz waleni, do szerokiego zakresu gatunków Cetartiodactyla, w tym gatunków domowych i dzikich, w szczególności szeroko rozpowszechnionych Ruminantia (Bovidae, Capridae i najprawdopodobniej Cervidae). Nie jest ona jednak odpowiednia dla Suiformes i wymagane są dalsze badania w celu potwierdzenia, że technika ta nie ma również zastosowania do Camelidae, biorąc pod uwagę ich jeszcze bardziej podstawową pozycję w filogenezie Cetartiodactyla.

Użycie w ocenie rodowodów i genetyce populacji

W delfinach, fragmenty Amel-Y amplifikowane z parą starterów SC1-SC2 były łatwo sekwencjonowane bez potrzeby klonowania, ponieważ amplifikacja była specyficzna dla chromosomu Y. Z dziesięciu zsekwencjonowanych próbek delfina pasiastego, dziewięć było samcami i mogliśmy wydedukować siedem odrębnych haplotypów Y (jeden haplotyp reprezentowany przez trzy osobniki i cztery indywidualne haplotypy) posiadających 64 miejsca polimorficzne (różnorodność nukleotydów π = 0,004 ± 0,0007). Połowa z nich znajdowała się w insercji ~460 bp. Wyrównanie miejsc polimorficznych przedstawiono na Rysunku 5 (a). Uderzająco, sekwencje te wykazały dwie wysoce rozbieżne haplogrupy, różniące się średnio o 49 substytucji. Zgadza się to z naszymi wynikami, które potwierdzają prawdopodobne istnienie dwóch podgatunków w obrębie Morza Śródziemnego (dane niepublikowane). Co więcej, jedna z tych haplogrup wykazywała wysoki stopień polimorfizmu, z 24 miejscami informacyjnymi, podczas gdy inne wykazywały tylko osiem. Wartości te są wystarczające do wykorzystania w analizie rodowodowej i genetyce populacyjnej, jako chromosomowy odpowiednik mitochondrialnej pętli d u tego gatunku. Rzeczywiście, u delfina pasiastego dywergencja wewnątrzgrupowa jest większa niż międzygrupowa, ze średnią 45 nukleotydowych substytucji między sekwencjami delfina pasiastego i wieloryba płetwiastego. Istnieje średnio 0,048 ± 0,01 substytucji na miejsce przy porównywaniu dwóch populacji delfinów pręgowanych. Jest to porównywalne z dywergencją obserwowaną między każdą z populacji a delfinem zwyczajnym (0,058 ± 0,03) i potwierdza, że różnorodność nukleotydów jest o jeden rząd wielkości wyższa niż zakres obserwowany (10-4) dla markerów chromosomu Y u ssaków. Podobnie jak w przypadku mitochondrialnej pętli d, rozmiar amplifikowanego fragmentu nieznacznie ogranicza zastosowanie tej techniki. Niektóre zdegradowane próbki nie ulegają amplifikacji; nawet tak, szczególnie zdegradowana próbka wieloryba spermy była nadal amplifikowana (dane nie pokazane).

Ponieważ oczekuje się, że populacja chromosomu Y będzie miała mały efektywny rozmiar, jest bardziej prawdopodobne, że wpłynie na nią dryf genetyczny. Tak więc odzwierciedla on bardziej niedawne wydarzenia demograficzne, takie jak wąskie gardła, ekspansje lub efekty założycielskie. Do badania tego typu zdarzeń potrzebny jest marker, którego różnorodność jest wystarczająco wysoka, aby umożliwić rekonstrukcję genealogii z jak najmniejszą niejednoznacznością i w regionach, w których rekombinacja nie zakłóca unikalności drzew. Do tego celu cennymi markerami są wysoce zmienne mikrosatelity, ale wymagają one intensywnych metod obliczeniowych, aby uwzględnić niepewności w drzewach wynikające z alleli identycznych ze względu na stan, a nie pochodzenie (homoplazje). Dodanie nowego markera sekwencji jest więc interesujące dla genetyki populacyjnej chromosomu Y u Cetartiodactyla. Ponadto, bayesowskie oszacowanie tempa mutacji na każdej krawędzi obu drzew na Rys. 4, obliczone wspólnie z wnioskowaniem filogenetycznym, wykazuje wysokie wartości dla markera jądrowego DNA: między 10-8 a 10-10 substytucji na miejsce i na rok we wszystkich gałęziach Cetartiodactyla. Wartość ta jest pośrednia między tymi z mitochondrialnego d-loop i DNA jądrowego u ssaków .

Funkcjonalne perspektywy w ewolucji amelogeniny

Znaleźliśmy dwa kodony stopu w pozycjach aminokwasowych 98 i 99 egzonu 5 we wszystkich kopiach chromosomu Y amelogeniny w czterech badanych gatunkach waleni (pozycje 988-993 sekwencji EMBL:AM744959). Produkt genu Amel-Y może być zatem obcięty u tych gatunków lub reprezentować pseudogen, jak to już zaobserwowano u gatunków z większości innych kladów euteryków

.