Zwierzęta
S. purpuratus były utrzymywane w sztucznej wodzie morskiej w temperaturze 14 °C. L. anatina zostały zebrane w czerwcu 2016 roku w mokradłach Xiangshan, Xiangshan District, Hsinchu City, Tajwan (współrzędne GPS 24.770779, 120.910742 E), przetransportowane do laboratorium na lodzie, a następnie natychmiast rozczłonkowane.
Konstrukcje i plazmidy
Aby określić aktywność enzymatyczną SpAIDLs i LaAIDLs, wygenerowano odpowiednie bakteryjne wektory ekspresyjne pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID dla SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 i HsAID. Otwarte ramki odczytu każdej SpAIDL amplifikowano z genomowego DNA metodą PCR przy użyciu polimerazy Phusion i starterów zawierających miejsca restrykcyjne SpeI i XhoI (Tabela 1). Produkty PCR trawiono SpeI i XhoI (New England Biolabs) i wstawiano do miejsc NheI/XhoI w pASK-TadA (dar od dr Niny Papavasiliou, Uniwersytet Rockefellera, Nowy Jork) zastępując otwartą ramkę odczytu TadA. Dla SpAIDL9 ta strategia klonowania zmieniła trzeci aminokwas z fenyloalaniny na serynę, a ta mutacja F3S została odwrócona z powrotem do F3 przy użyciu zestawu do mutagenezy Quikchange (Stratagene) ze starterami SPA9S3FT/SPA9S3FB (Tabela uzupełniająca 1). HsAID amplifikowano z plazmidu zawierającego ludzki AID pełnej długości (pCDF-AID, dar od dr Niny Papavasiliou, Rockefeller University, Nowy Jork). Strategia klonowania zmieniła drugi aminokwas z asparaginianu na alaninę, a D2A zostało przekształcone z powrotem w D2 przy użyciu zestawu do mutagenezy Quikchange (Stratagene) ze starterami hAIDA2DT/hAIDA2DB (Tabela uzupełniająca 1). Pusty pASK został wygenerowany przez trawienie NheI/XhoI pASK-TadA, wypełnienie nawisów przy użyciu polimerazy Klenowa i ligację ligazą T4 DNA (Thermo Scientific). Otwarte ramki odczytu każdej LaAIDL amplifikowano z cDNA L. anatina i klonowano do wektora klonującego pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Otwarte ramki odczytu LaAIDLX zostały wycięte przy użyciu SpeI i XhoI (New England Biolabs) i sklonowane do miejsc XbaI/XhoI wektora pASK_V5-SpAID4a (opisanego poniżej), zastępując insert SpAID4a. Należy zauważyć, że sklonowane fragmenty zawierają oryginalne kodony stop na swoich 3′ końcach, tak że wyrażone białko nie zawiera znacznika V5.
Konstrukcje ekspresyjne dla mutantów miejsca aktywnego SpAIDL1 i LaAIDL1 (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, i LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) zostały wygenerowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce z odpowiednich plazmidów typu dzikiego (lub pojedynczych mutantów) przy użyciu zestawu do mutagenezy Quikchange (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB dla SpAIDL1 RQ), lub metodą konwencjonalnego PCR z użyciem 5′-fosforylowanych primerów (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB dla drugiego zestawu zmian w SpAIDL1 RQAA, oraz LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P i LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P dla SpLaAIDL1 RQRQ), po czym następuje trawienie DpnI, ligacja w celu kolokalizacji produktów i transformacja do kompetentnej E. coli.
Aby monitorować poziom ekspresji rekombinowanego białka w E. coli, utworzono bakteryjne konstrukty ekspresyjne pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID. pASK_V5 wygenerowano przez annealgowanie oligonukleotydów pASK_V5F/pASK_V5R (Tabela uzupełniająca 1) zawierających sekwencję znacznika V5 i ligację ich do miejsc NheI/SalI w pASK-TadA. Plazmidy pASK-SpAIDLX/LaAIDLX zostały użyte jako szablony do amplifikacji odpowiednich cDNA bez kodonu stop, przy użyciu polimerazy Phusion i starterów wymienionych w Tabeli Dodatkowej 1, a następnie sklonowane do miejsc NheI/XhoI (dla fragmentów SpAIDLX i HsAID) lub XbaI/XhoI (dla fragmentów LaAIDLX) pASK_V5. HsAID amplifikowano z pASK-hAID. Sekwencje obu, SpAIDL9 i HsAID, zostały ponownie zmienione przez tę strategię klonowania, i zostały zmienione z powrotem na prawidłowe sekwencje, jak opisano powyżej.
Przygotowanie genomowego DNA
Genomowe DNA obu, S. purpuratus i L. anatina, zostało oczyszczone przy użyciu gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, około 1 × 106 koelomocytów S. purpuratus i 100 mg tkanki L. anatina dodawano do oddzielnych probówek mikrowirówki, homogenizowano w 200 µl buforu GT (Bioman) zawierającego 200 mg proteinazy K i inkubowano przez 30 min w 60 °C w celu całkowitego zlizywania komórek. Po dodaniu 200 µl buforu BG (Bioman), próbki wirowano i inkubowano przez 20 min w temp. 70 °C. Następnie dodano 200 µl etanolu i całą próbkę załadowano na kolumnę wirową GD (Bioman). Przemywano 400 µl buforu WI (Bioman) i 600 µl buforu przemywającego przez wirowanie przy 10,000×g przez 30 s. Następnie eluowano genomowe DNA za pomocą 100 µl buforu elucyjnego (10 mM Tris pH = 8,0), który był wstępnie ogrzany do 60 °C.
Preparacja RNA i synteza cDNA
Płyn koelomowy S. purpuratus pobierano strzykawką przez błonę okostnową i natychmiast mieszano z równą objętością CMSFW-EI (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidazolu). Koelomocyty odwirowywano i ponownie zawieszano w 800 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman). Przełyk, jelito cienkie, jelito grube i gonady S. purpuratus oraz szypułę, jelito ślepe, gonadę i jelito L. anatina wypreparowano z poszczególnych zwierząt. Małe kawałki tkanek stałych S. purpuratus i L. anatina dodawano do 200 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman), a następnie próbki homogenizowano w Bullet Blender (Next Advance) przy użyciu 0,5 mm kulek ZrO. Nierozpuszczalne resztki odwirowywano, a supernatanty przenoszono do świeżych probówek zawierających 600 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) i 200 μg glikogenu jako nośnik. Następnie całkowity RNA oczyszczano zgodnie z protokołem producenta. W celu usunięcia resztkowego gDNA i innych zanieczyszczeń, RNA S. purpuratus poddawano dalszej obróbce przy użyciu zestawu Turbo DNA-free (Ambion) lub zestawu RNeasy mini (Qiagen). Zestaw Turbo DNA-free kit (Ambion) był używany zgodnie z protokołem producenta, z wyjątkiem dodania dodatkowych MgCl2 (2,5 mM) i CaCl2 (1 mM) do trawienia DNazą. Zestaw RNeasy mini (Qiagen) został użyty zgodnie z protokołem producenta.
Około 250-500 ng RNA S. purpuratus i L. anatina z każdej tkanki zostało przekształcone do cDNA przy użyciu odpowiednio ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) lub ToolsQuant II Fast RT Kit (Biotools). W obu przypadkach stosowano heksamery losowe i postępowano zgodnie z instrukcjami producenta.
Szybka amplifikacja końców cDNA
Końce 5′ i 3′ transkryptów SpAIDL9 amplifikowano przy użyciu zestawu SMARTer RACE (Clontech) i specyficznych dla danego genu primerów SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (patrz Tabela uzupełniająca 2) zgodnie z instrukcjami producenta. Produkty PCR zawierające 5′ i 3′ końce transkryptów klonowano do wektora pJET1.2/blunt cloning (Thermo Scientific), a poszczególne klony sekwencjonowano w całości.
Analiza sekwencji genów SpAIDL
Genomowe DNA od trzech osobników S. purpuratus (Sp105, Sp111, Sp112) wykorzystano jako szablony do amplifikacji otwartych ramek odczytu genów SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 przy użyciu polimerazy Phusion i starterów wymienionych w Tabeli Dodatkowej 2. Produkty PCR klonowano do wektora klonującego pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Plazmidy oczyszczono przy użyciu zestawu plazmidowego Tools mini (Biotools) i przekazano do komercyjnego serwisu (Genomics Taiwan) w celu sekwencjonowania przy użyciu starterów pJET1.2 forward lub pJET1.2 reverse.
Przynajmniej osiem sekwencji zebrano dla każdego genu z każdego jeżowca, a sekwencje starterów wykluczono przed wyrównaniem sekwencji. Sekwencje nukleotydów dla każdego genu zostały najpierw wyrównane w obrębie każdego S. purpuratus przy użyciu CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw), a dominujące sekwencje odpowiadające dwóm allelom zostały wybrane do późniejszego porównania między poszczególnymi jeżowcami.
Analiza ekspresji genów
Komplementarne DNA z trzech osobników S. purpuratus (Sp146, Sp147, Sp148) i dwóch osobników L. anatina (La1 i La3) wykorzystano jako szablony do badania ekspresji SpAIDL1, 2, 3, 4a, i 9, lub LaAIDL1 i 2 metodą ilościowego PCR. Każda reakcja qPCR (10 μl) zawierała 5 μl Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), primery (0,1 μM) (patrz Tabela 3) i 1 μl szablonu, a dla każdej próbki ustawiono dwa powtórzenia techniczne. Reakcje qPCR przeprowadzono w urządzeniu 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems), stosując wstępny etap denaturacji w 95 °C przez 20 s, a następnie 40 cykli po 3 s w 95 °C i 30 s w 60 °C. Krzywe standardowe zostały użyte do określenia poziomów ekspresji genów, a geny housekeeping (Sp18S dla S. purpuratus i LaRPL39 dla L. anatina) zostały użyte do normalizacji.
Model infekcji bakteryjnej
Vibrio diazotrophicus hodowano w płynnych kulturach Difco marine broth (Becton Dickinson) w temperaturze 30 °C i 250 rpm przez noc. Sześć zdrowych jeżowców zostało losowo wybranych i podzielonych na dwie grupy, grupę eksperymentalną i grupę kontrolną. Z każdego zwierzęcia pobrano porcję płynu jelitowego (0,5 ml) w t = 0. Jeżowcom z grupy doświadczalnej wstrzykiwano zawiesinę żywego Vibrio diazotrophicus w 200 µl sterylnej sztucznej wody morskiej, przy czym ilość bakterii dostosowano dla każdego jeżowca tak, aby odpowiadała 106 komórkom/ml całkowitej objętości płynu jelitowego. Grupie kontrolnej wstrzyknięto 200 µl sterylnej wody morskiej. W t = 6, 24, i 48 h od każdego zwierzęcia w każdej grupie pobrano 200 µl płynu koelomijnego. Z koelomocytów uzyskanych w każdym punkcie czasowym ekstrahowano RNA, a z próbek z t = 0 przygotowywano również genomowe DNA. Pary primerów do analizy ekspresji genów (Tabela Uzupełniająca 3) zostały najpierw przetestowane na próbkach genomowego DNA, aby upewnić się, że mogą one amplifikować odpowiedni gen od każdego osobnika, pomimo znaczących poziomów polimorfizmu w ich sekwencji w obrębie populacji S. purpuratus (patrz Rys. 1b). Ilościowa RT-PCR (jak opisano powyżej) została użyta do pomiaru poziomów ekspresji genów z co najmniej dwoma powtórzeniami technicznymi na próbkę. Wartości ekspresji zostały najpierw znormalizowane do poziomów 18S w każdej próbce, a następnie do wartości w t = 0 dla każdego zwierzęcia. Zastosowano trzy powtórzenia biologiczne dla grupy eksperymentalnej i kontrolnej, a wszystkie punkty danych są pokazane.
Testy CDA z reporterem oporności na kanamycynę
Zastosowano zoptymalizowany protokół szeroko stosowanego testu do pomiaru aktywności CDA polinukleotydów26. Plazmid reportera deaminazy pTAC-Kan zawierający mutację punktową L94P w genie KanR oraz poszczególne wektory ekspresyjne pASK-SpAIDLX/LaAIDLX transformowano sekwencyjnie do szczepu BH156 E. coli wykazującego niedobór UNG. Ludzki wektor ekspresyjny AID pASK-HsAID i pusty wektor pASK służyły odpowiednio jako kontrola pozytywna i negatywna. Dla oznaczenia deaminazy, co najmniej osiem pojedynczych kolonii dla każdej domniemanej deaminazy hodowano w bulionie LB (zawierającym 50 μg/ml ampicyliny (Amp), 50 μg/ml spektynomycyny (Spc) i 17 μg/ml chloramfenikolu (Cam)), aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnęła 0,3. Następnie każda hodowla była dzielona na pół. Podczas gdy do obu dodawano IPTG (1 mM), anhydrotetracyklinę (AHT) (0,2 μg/ml) dodawano tylko do jednej z nich, aby indukować ekspresję SpAIDLX/LaAIDLX. Po inkubacji przez 3 h w 37 °C i 200 rpm, hodowle odwirowano, przemyto PBS i rozprowadzono na płytki LB zawierające albo 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc i 17 μg/ml Cam, albo 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc, 17 μg/ml Cam i 30 μg/ml kanamycyny (Kan). Częstości odwracania obliczano jako stosunek liczby kolonii KanR do całkowitej liczby kolonii na płytce Amp+Spc+Cam. Względna częstotliwość rewersji została następnie określona jako stosunek częstotliwości rewersji z jednej pary identycznych hodowli bakteryjnych, w których transkrypcja KanR była indukowana IPTG w obecności lub przy braku ekspresji deaminazy. Aby potwierdzić, że kolonie KanR rzeczywiście były wynikiem deaminacji DNA, plazmidy pTAC-Kan z wielu kolonii zostały oczyszczone, a odwrócenie kodonu stop zostało potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA.
Testy CDA z użyciem rpoB jako reportera
Zastosowano zoptymalizowany protokół szeroko stosowanego testu do pomiaru aktywności CDA polinukleotydów35. Poszczególne wektory ekspresyjne pASK bezkręgowych deaminaz transformowano oddzielnie do BH156 E. coli z niedoborem UDG. Pojedyncze kolonie bakterii zaszczepiano czterema ml podłoża LB zawierającego 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam i 0,3 µg/ml AHT. Hodowle hodowano przez 24 h w 37 °C 230 rpm, a następnie podwielokrotności posiewano na płytki agarowe LB zawierające 100 µg/ml Amp lub 100 µg/ml rifampicyny i hodowano w 37 °C przez noc. Kolonie były liczone, a częstość rewersji obliczano jako stosunek liczby kolonii RifR do liczby kolonii AmpR z tej samej hodowli. Hodowle wyrażające HsAID lub zawierające pusty wektor ekspresyjny pASK służyły odpowiednio jako kontrola pozytywna i negatywna. Przetestowano co najmniej osiem hodowli na konstrukt ekspresyjny. W celu określenia tożsamości mutacji w genie rpoB z kolonii opornych na ryfampicynę, przeprowadzono PCR z 24 pojedynczych kolonii przy użyciu polimerazy Phusion i pary primerów rpoBF/rpoBR. Produkty PCR oczyszczano w żelu i poddawano sekwencjonowaniu z użyciem startera rpoBF. Mutacje zidentyfikowano przez porównanie z sekwencją WT (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797).
Ekspresja białek bezkręgowych deaminaz w E. coli
Do monitorowania poziomu ekspresji SpAIDLX/LaAIDLX w testach deaminazowych, pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX transformowano do BH156 z niedoborem UNG. Poszczególne kolonie hodowano w bulionie LB (zawierającym 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc i 17 μg/ml Cam), aż gęstość optyczna przy 600 nm wynosiła 0,3. Do hodowli dodawano IPTG (1 mM) i AHT 0,2 (μg/ml) w celu indukcji ekspresji białka. Po inkubacji przez 3 h (37 °C, 200 obr./min.), hodowle peletowano i przemywano PBS. Osad był lizowany w 2x SDS buforze do próbek, rozcieńczany dziesięciokrotnie i rozdzielany na parze 10% żeli SDS-PAGE. Podczas gdy jeden żel był barwiony błękitem Coomassie, aby ocenić, czy równe ilości białek zostały załadowane, drugi żel był przenoszony na membrany PVDF metodą półsuchego transferu, a deaminazy znakowane V5 były wykrywane przy użyciu mysiego przeciwciała pierwotnego anty-V5 (Abcam, ab27671) i peroksydazy chrzanowej sprzężonej z króliczym przeciwciałem wtórnym (Jackson ImmunoReasearch). Sygnały chemiluminescencyjne były wizualizowane przy użyciu Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) i kliszy rentgenowskiej lub systemu obrazowania ChemiDoc Touch (BioRad). Nieprzycięte obrazy wszystkich wybarwionych żeli białkowych i Western Blots są pokazane na Rys. 5 uzupełniającym. Wszystkie eksperymenty z ekspresją bakterii wykonano w dwóch egzemplarzach.
Bioinformatyka
Porównania sekwencji z genomem jeżowca wykonano przy użyciu BLAST, BLASTP, lub BLASTN na https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi lub www.echinobase.org stosując standardowe parametry lub z wyłączonym filtrem niskiej złożoności. Wielokrotne wyrównania sekwencji wykonano przy użyciu CLUSTALW i zoptymalizowano ręcznie na podstawie przewidywanych cech struktury drugorzędowej. Analizy filogenetyczne i ewolucji molekularnej przeprowadzono przy użyciu programu MEGA (wersja 7)36.
Dostępność danych
Dane sekwencji, które wspierają wyniki tego badania, zostały zdeponowane w Genbanku z następującymi kodami akcesyjnymi: SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).