May 12, 2018
Jednym z powszechnych pytań, które naukowcy zawsze zadają, gdy otrzymują sygnał z testu opartego na przeciwciałach, jest: „Czy ten signaltruly reprezentuje obecność i ilość mojego białka?”
Swoistość przeciwciał jest zawsze zmartwieniem dla naukowców. Nawet jeśli istnieje wiele metod walidacji, które zostały użyte do testowania specyficzności, dane są często nadinterpretowane. Dane badawcze z różnych grup wykazały, że powszechnie stosowane na rynku przeciwciała monoklonalne w rzeczywistości nie są monospecyficzne. Mogą one reagować krzyżowo z innymi białkami.A reaktywność krzyżowa może wprowadzać badaczy w błąd, dając fałszywie pozytywne wyniki i potencjalnie powodować nieoczekiwane efekty uboczne i fałszywe raporty diagnostyczne dla klinicystów.
Jakich więc kontroli powinniśmy używać do walidacji swoistości przeciwciał?
Linie komórkowe i tkanki, które wyrażają białka docelowe w dużych ilościach, mogą być używane jako pozytywne kontrole do walidacji przeciwciał.Może to być białko endogenne lub białko poddane ekspresji, kodowane przez klon cDNA. Jednakże, kontrola pozytywna nie będzie w stanie potwierdzić specyficzności przeciwciała. Można zobaczyć pasmo o prawidłowym rozmiarze lub pozytywne barwienie we właściwej lokalizacji subkomórkowej, ale wszystkie te sygnały mogą być fałszywie pozytywne z powodu reaktywności krzyżowej przeciwciał. Tak więc zwykle do walidacji przeciwciał wymagana jest kontrola negatywna do oceny wiązania niespecyficznego.
Walidacja knockout jest jak dotąd najlepszą kontrolą negatywną do oceny specyficzności przeciwciał. W walidacji knockout,przeciwciało jest testowane na linii komórkowej knockout, która nie wykazuje ekspresji białka docelowego. Począwszy od 2017 roku, OriGene współpracuje z EdiGene, innowatorem CRISPR, aby produkować podwójnie znokautowane komórki w sposób wysokowydajny. W przeciwieństwie do linii komórkowej knockout firmy Horizon, linie komórkowe knockout OriGene pochodzą z powszechnie stosowanych linii komórkowych, takich jak HEK293T lub HeLa, dzięki czemu produkt jest bardziej przydatny dla badaczy.W tej podwójnie znokautowanej linii komórkowej cel przeciwciała nie jest obecny, ponieważ gen kodujący białko jest wyeliminowany lub „znokautowany”. Próbki z komórek znokautowanych i komórek rodzicielskich (typu dzikiego) są testowane obok siebie przeciwko temu samemu przeciwciału i jeśli przeciwciało jest rzeczywiście specyficzne, powinno wykrywać specyficzny sygnał tylko w komórkach typu dzikiego, ale nie w linii komórek znokautowanych. Używając lizatów z tych znokautowanych komórek, zwalidowaliśmy ponad 100 przeciwciał monoklonalnych (zwalidowane przeciwciała KO). Uważa się, że walidacja nokautów oferuje prawdziwą kontrolę negatywną dla testowania swoistości przeciwciał.
Czy jednak walidacja nokautów jest wystarczająca do potwierdzenia monospecyficzności przeciwciała? Przede wszystkim, efekty poza celem komórek znokautowanych nie są dobrze zbadane na tym etapie. Więc możesz mieć komórkę nokautującą nie tylko eliminującą ekspresję interesującego Cię białka, ale również eliminującą lub redukującą ekspresję innego białka, które może być białkiem reagującym krzyżowo z przeciwciałem. Tak więc negatywny sygnał nie zawsze oznacza, że przeciwciało nie będzie reagować z żadnym innym białkiem, z wyjątkiem białka będącego przedmiotem zainteresowania. Po drugie, testowanie przy użyciu znokautowanych komórek/tkanek jest możliwe tylko dla białek nieistotnych. Dla białek istotnych, knockout jest niemożliwy. Tak więc dla tych białek potrzebny jest inny sposób testowania swoistości przeciwciała.
Kilka lat temu firma OriGene opracowała metodę tablic białkowych do testowania swoistości przeciwciał. Posiadając największą na świecie kolekcję lizatów nadekspresji, stworzyliśmy unikalny proteinchip, który zawiera >10k nadekspresjonowanych białek ludzkich w duplikatach na pojedynczym szkiełku szklanym pokrytym nitrocelulozą. Ta technologia mikromacierzy białkowej została wykorzystana do walidacji specyficzności wielu przeciwciał monoklonalnych OriGeneUltraMAB™. Poprzez zwiększenie liczby białek na chipie, reaktywność krzyżowa przeciwciała może być dalej badana w całym ludzkim proteasomie.
Podsumowując, testowanie swoistości przeciwciał jest dość skomplikowane. Wymaga walidacji za pomocą wielu narzędzi i kierunków.W miarę postępu technologicznego, będziemy dysponować bardziej wartościowymi aktywami i znormalizowanymi procedurami walidacji przeciwciał.Naukowcy nie będą musieli stawiać czoła tym samym pytaniom, gdy otrzymają pozytywne sygnały ze swoich testów opartych na przeciwciałach.