Antyglikemiczny efekt ekstrahowanego wodą arabinoksylanu z aleuronu i otrąb pszenicy

Abstract

Badania nad wpływem polisacharydów arabinoksylanu (AX) na poposiłkową odpowiedź glukozy przyniosły kontrastujące wyniki z powodu różnorodności struktur AX. Cztery ekstrakty wodne AX (WEAX) uzyskane z aleuronu i otrąb pszennych zostały użyte do zbadania (a) wpływu AX na aktywność α-amylazy i α-glukozydazy, (b) wpływu składu chemicznego AX na ich siłę inhibicji oraz (c) kinetyki inhibicji enzymów. Obecność frakcji WEAX nie miała istotnego wpływu na aktywność α-amylazy, niezależnie od rodzaju i stężenia. WEAX hamował aktywność α-glukozydazy tylko wtedy, gdy jako substratu użyto maltozy, ale nie sacharozy. Wartości IC50 dla WEAX (- mg/mL) były silnie skorelowane z zawartością kwasu ferulowego (), stosunkiem arabinozy do ksylozy () oraz względnymi proporcjami ksylozy niepodstawionej (), niepodstawionej () i jednopodstawionej (). Wykres Lineweavera-Burka sugeruje niekompetycyjny sposób hamowania enzymu. Tak więc, nasze wyniki sugerują, że właściwości antyglikemiczne WEAX mogą pochodzić z bezpośredniego hamowania aktywności α-glukozydazy.

1. Wprowadzenie

Chorobowość na cukrzycę typu 2 wzrasta na całym świecie. Cukrzyca jest chorobą przewlekłą, uosabianą przez wysokie stężenie glukozy w osoczu. Dlatego zarządzanie poposiłkowym stężeniem glukozy ma kluczowe znaczenie w zapobieganiu i leczeniu pacjentów z cukrzycą typu 2. Badania interwencyjne na ludziach wykazały, że spożywanie diety bogatej w arabinoksylany (AX) zmniejsza poposiłkowe stężenie glukozy we krwi u osób zdrowych, z upośledzoną tolerancją glukozy i chorych na cukrzycę. W przeciwieństwie do tego, Mohlig i współpracownicy nie stwierdzili żadnego wpływu na odpowiedź glukozy, gdy zdrowym ludziom podawano bułki z dodatkiem AX. W badaniach na zwierzętach również odnotowano mieszane wyniki dotyczące wpływu suplementacji AX. Podstawowe mechanizmy pozostają niejasne, ale uważa się, że rozpuszczalne włókna zwiększają lepkość światła jelita, opóźniając w ten sposób wchłanianie składników odżywczych. Na pozorną lepkość roztworów AX ma wpływ asymetryczna konformacja i masa cząsteczkowa AX, jak również stężenie polimeru. Z tych trzech czynników, stężenie AX wydaje się mieć największy wpływ na lepkość. Tak więc wpływ AX na stężenie glukozy we krwi jest zależny od dawki. Lepkość pozorna roztworów AX jest również zależna od naprężenia ścinającego, tak że większe ścinanie powoduje rozrzedzenie ścinające, zachowanie charakterystyczne dla płynów nienewtonowskich. Ostatnie badania sugerują, że efekt lepkości AX może być zrównoważony przez silną perystaltykę jelit .

Struktura molekularna AX jest złożona i heterogeniczna. AX składają się z ksylanowego szkieletu zbudowanego z () połączonych reszt β-D-ksylopiranozylowych (Xylp) z resztami α-L-arabinofuranozylowymi (Araf) połączonymi z ksylanowym szkieletem w pozycjach C(O)-2 i C(O)-3 i/lub zarówno w pozycjach C(O)-2 jak i C(O)-3 . Pozostałości ksylozy mogą być również zastąpione wiązaniami kwasu glukuronowego i/lub metylo-glukuronowego . Pozostałości kwasu ferulowego lub kumarowego są połączone estrowo z resztami arabinozy w pozycji C(O)-5 . Stosunek arabinozy do ksylozy, wzór podstawienia arabinozy, stopień feruloilacji i masa cząsteczkowa różnią się znacznie między ziarnami zbóż i w ich obrębie. Arabinoksylany (AX) stanowią największą część błonnika pokarmowego w ziarnach zbóż (60-70%), a ich zawartość zmienia się w zależności od źródła pochodzenia lub frakcji ziarna. W pszenicy AX stanowią 1,3-2,7% w/w. Aleuron i owocnia pszenicy zawierają odpowiednio 20 i 45% AX. Znaczna część AX w pszenicy jest nierozpuszczalna w wodzie (70-86%).

Dietetyczne węglowodany strawne są hydrolizowane do cukrów monomerycznych, glukozy lub fruktozy przed ich wchłonięciem w przewodzie pokarmowym. Skrobia jest trawiona głównie do maltozy i innych krótkołańcuchowych węglowodanów przez amylazę ślinową i trzustkową. Powstałe w ten sposób (maltoza, maltotrioza i dekstryny α-limitowe) oraz sacharoza są trawione do glukozy lub fruktozy przez α-glukozydazy na granicy szczoteczek jelita cienkiego (maltazę-glukoamylazę i sacharozę-izomaltazę). Wchłanianie cukrów w jelicie cienkim odbywa się głównie przy udziale transporterów GLUT2, GLUT5 i SGLT1. Dlatego też obniżenie poposiłkowej hiperglikemii można osiągnąć poprzez ograniczenie jelitowego trawienia lub wchłaniania węglowodanów. Pomimo ogromnych różnic w budowie AX, większość badań podaje bardzo mało lub nie podaje żadnych szczegółów dotyczących składu lub struktury użytych AX, co utrudnia porównanie wyników dotyczących wpływu AX na poposiłkowe stężenie glukozy we krwi. Istnieją również bardzo ograniczone dane na temat wpływu oczyszczonych AX na enzymy trawienne węglowodanów. Dlatego w niniejszej pracy starano się zbadać (a) wpływ AX na aktywność α-amylazy i α-glukozydazy, (b) wpływ składu chemicznego AX na siłę ich hamowania oraz (c) kinetykę inhibicji enzymów.

2. Materiały i Metody

2.1. Chemicals and Reagents

Komercyjny aleuron pszenny (Grainwise wheat aleurone) był darem od Cargill Limited i Horizon Milling (Wichita, Kansas, USA). Składa się on odpowiednio z 4.5, 15.2, 7.4 i 2.5% lipidów, białka, popiołu i skrobi. Otręby z pszenicy ozimej twardej czerwonej zakupiono lokalnie w Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Kanada). Ich zawartość wilgoci, popiołu i białka wynosiła odpowiednio 5,8, 5,3 i 11,1%. Skrobia niemodyfikowana pszenna, maltoza, sacharoza, akarboza, α-amylaza z trzustki świńskiej (EC 3.2.1.1, typ VI-B), amyloglukozydaza (EC 3.2.1.3) z aspergillusa oraz aceton jelitowy w proszku od szczura zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Siarczan amonu, wszystkie kwasy i rozpuszczalniki organiczne zostały zakupione od Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Kanada). Zestaw do oznaczania maltozy, sacharozy i glukozy (K-MASUG 08/13) zakupiono w firmie Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Irlandia). Wszystkie użyte chemikalia były klasy analitycznej lub HPLC.

2.2. Water Extractable Arabinoxylan Preparation

Enzymy endogenne inaktywowano poprzez gotowanie próbek otrębów pszennych i aleuronu pszennego (~200 g) w 2 L wodnego etanolu (80%, v/v) w temperaturze 85°C pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Supernatant odrzucono, a pozostałość suszono na powietrzu w kapturze dymowym przez noc w temperaturze pokojowej. Z wysuszonych na powietrzu otrąb lub aleuronu (150 g) w temperaturze 45°C wyodrębniono frakcje wodorozcieńczalne zgodnie z metodą opisaną przez Izydorczyka i Biliaderisa. Ekstrakt wodny poddano destylacji z użyciem α-amylazy (1821 U/L) oraz deproteinizacji za pomocą celitu i ziemi fulerskiej. Oczyszczony materiał frakcjonowano przez stopniowe strącanie siarczanem amonu (AS), otrzymując frakcje o nasyceniu 50 i 75% AS. Zebrany materiał po dializie (membrana 12 kDa cut-off) przez 48 godzin poddano liofilizacji. Frakcje ekstrahowalne wodą zebrane z aleuronu pszenicy oznaczono (WA), a następnie podano stężenie AS, przy którym je uzyskano (WA-f50 i WA-f75). Podobnie, materiały zebrane z otrąb pszennych (WB) oznaczono jako WB-f50 i WB-f75. Opisy chemiczne i strukturalne frakcji WEAX przedstawiono w tabeli 1.

2.3. Inhibition Assay for α-Amylase Activity

Skrobię pszenną (300 mg) zawieszono w 15 mL buforu fosforanu sodu (pH 6,9, 0,1 M) zawierającego 1 mM chlorku wapnia i gotowano w 95°C przez 15 minut . Frakcje WEAX (40 mg) zostały rozpuszczone w 2 mL buforu fosforanu sodu. Próbki rozcieńczano tak, aby końcowe stężenie w mieszaninie reakcyjnej wynosiło 0,0, 0,2, 0,3 i 0,5% (w/v). Równe objętości (200 μL) skrobi i WEAX (lub kontroli) mieszano i worteksowano. Hydrolizę skrobi inicjowano dodając 70 μL α-amylazy z trzustki świńskiej (130 U/mL) i 40 μL amyloglukozydazy grzybowej (240 U/mL). Reakcję zatrzymano po 30 minutach przez ogrzewanie w temperaturze 95°C przez 5 minut. Mieszaninę natychmiast schłodzono na lodzie i odwirowano (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Niemcy). Supernatanty zebrano i poddano analizie na obecność glukozy przy użyciu zestawu do testu na obecność glukozy Megazyme. Badania interwencyjne u ludzi wykazały skuteczność stężenia 0,25 do 0,70% AX i stąd nasz wybór zakresu stężeń.

2.4. Inhibition Assay for Rat Intestinal α-Glucosidase Activity

Metoda hamowania α-glukozydazy autorstwa Oki et al. została wykorzystana z modyfikacjami. Krótko mówiąc, proszek acetonu z jelita szczura (500 mg) został zmieszany z 10 mL buforu fosforanu sodu (pH 6.9, 0.1 M) i sonikowany w łaźni lodowej przez 30 sekund (12 razy) z 15 sekundową przerwą, aby zapobiec gromadzeniu się ciepła. Następnie mieszaninę odwirowywano przy 10000 w 4°C przez 10 minut. Supernatant zbierano i oznaczano szczurzą α-glukozydazę jelitową. Próbki WEAX (40 mg) zostały rozpuszczone w 2 mL buforu fosforanu sodu (pH 6,9, 0,1 M). Następnie 50 μL α-glukozydazy jelitowej szczura mieszano ze 100 μL próbki lub buforu (kontrola) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut. Dodawano 50 μL 20 mM sacharozy lub 4 mM maltozy i dalej inkubowano przez 60 minut (sacharoza) lub 30 minut (maltoza). Końcowe stężenie frakcji WEAX wynosiło 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, i 0.0% (w/v). Aktywność enzymu hamowano przez ogrzewanie w temp. 95°C przez 10 min. Po odwirowaniu przy 10000 przez 10 minut, supernatanty zbierano do analizy glukozy przy użyciu zestawu do testu glukozowego Megazyme GOPOD. % inhibicji alfa glukozydazy (sacharozy lub maltazy) obliczono jako . Wartość IC50 określono z wykresu % inhibicji α-glukozydazy względem stężenia próbki. W celu porównania wykonano również hamowanie α-glukozydazy jelitowej szczura akarbozą (znanym inhibitorem α-glukozydazy). Zamiast próbki zastosowano stężenia akarbozy 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8 i 13 μg/mL.

2.5. Analiza statystyczna

Wszystkie analizy przeprowadzono w sextuplicate (chyba że wskazano inaczej), a wszystkie statystyki obliczono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) na oprogramowaniu statystycznym JMP 12 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Średnie prób porównywano metodą Tukey HSD, a istotne różnice określano na poziomie . Korelacje między parametrami obliczono przy użyciu testu korelacji Pearsona.

3. Wyniki i dyskusja

Wpływ WEAX na hydrolizę skrobi przedstawiono na rycinie 1. Porównaliśmy ilość glukozy uwolnionej w ciągu 30 minut inkubacji z α-amylazą w obecności lub braku frakcji WEAX. Dodatek frakcji WEAX zmniejszał liczbowo ilość produkowanej glukozy w porównaniu z traktowaniem kontrolnym. Jednak statystyczne porównanie grup traktowanych i kontrolnej wykazało, że średnia różnica nie była istotna () dla WA-f50, WA-f75 i WB-f75 niezależnie od stężenia WEAX. Obecność 0,5% WB-f50 powodowała istotne zmniejszenie amylolizy w porównaniu do kontroli (). Obserwacje dotyczące aktywności alfa amylazy kontrastowały jednak z innymi doniesieniami literaturowymi, co mogło być spowodowane stężeniem i rodzajem AX. Amylolizę skrobi przeprowadzono w obecności 1 i 2% AX, przy czym zastosowany AX był pozbawiony kwasu ferulowego. Zastosowaliśmy stężenia AX (~5-10 g) odpowiadające stężeniom podawanym w celu obniżenia poposiłkowego stężenia glukozy we krwi w badaniach na ludziach.

Rycina 1

Wpływ ekstrahowanego wodą arabinoksylanu na hydrolizę skrobi.

W tabeli 2 przedstawiono wpływ WEAX na aktywność α-glukozydazy w obecności sacharozy lub maltozy jako substratu. Dane przedstawiono w postaci IC50, czyli stężenia inhibitora powodującego 50% zahamowanie aktywności α-glukozydazy. Wartości IC50 mieściły się w zakresie 4,88-10,14 mg/mL wobec aktywności α-glukozydazy z maltozą jako substratem. Nie zaobserwowano natomiast inhibicji w przypadku zastosowania jako substratu sacharozy. Siła hamująca WEAX wobec maltazy jelitowej była 1000-2000 razy mniejsza w porównaniu z akarbozą (kontrola pozytywna). Powszechna jest hipoteza, że lepkość może być przyczyną wpływu AX na poposiłkowe stężenie glukozy. Dlatego Vogel i wsp. karmili szczury zmodyfikowanymi otrębami pszennymi AX, aby zbadać wpływ lepkości. Ponadto, hamowanie jelitowej alfa glukozydazy przez mono-/oligosacharydy AX było również związane z zawartością kwasu ferulowego. Tak więc WA-f50 i WB-f75 miały znacząco różną siłę hamowania aktywności α-glukozydazy pomimo podobnych względnych proporcji niepodstawionych (un-Xylp), jednopodstawionych (2-Xylp lub 3-Xylp) i niepodstawionych reszt ksylozy (2,3-Xylp) oraz stopnia podstawienia, ale różnej zawartości kwasu ferulowego.

Stosunek arabinozy do ksylozy jest miarą stopnia podstawienia (DS). Zaobserwowano silny ujemny liniowy związek ( = -0,67) pomiędzy DS a IC50. Mogło to być konsekwencją zwiększonej rozpuszczalności AX z powodu wysokiego DS. Tak więc wysoko podstawione WEAX wydają się mieć niższą wartość IC50 (wysoka siła inhibicji). Tę samą obserwację potwierdza ujemna zależność pomiędzy siłą inhibicji a względnym udziałem niepodstawionych reszt ksylozowych. Pozorny stosunek reszt di-ksylowych do mono-ksylowych nie wydaje się mieć wpływu, ale zakres podstawienia ksylozy wykazał wpływ. Jest więc prawdopodobne, że wpływ na aktywność α-glukozydazy może pochodzić od reszt arabinozowych WEAX. Istnieją doniesienia o hamowaniu przez arabinozę aktywności α-glukozydazy. Próby usunięcia reszt arabinozowych z WEAX przy użyciu arabinofuranozydazy nie powiodły się, aby udowodnić tę hipotezę. Zauważyliśmy jednak, że mono-ksyl przy C (O)-2 był główną determinantą w porównaniu do mono-ksylu przy C (O)-3, co sugeruje, że siła inhibicji wykraczała poza samą obecność reszt arabinozy. Stwierdzono silną korelację pomiędzy mono-Xyl at C (O)-2 a zawartością kwasu ferulowego ( = 0,99). Tak więc możliwe jest, że obserwowany wpływ DS mógł być pochodną wpływu kwasu ferulowego.

Do obliczenia pozornej maksymalnej prędkości () i stałej Michaelisa-Mentena () dla aktywności α-glukozydazy na maltozie w obecności i nieobecności WEAX wykorzystano wykres Lineweavera-Burka (rys. 2). Wpływ frakcji WEAX na i analizowano w celu określenia rodzaju inhibicji. i α-glukozydazy dla maltozy przy braku frakcji WEAX wynosiły odpowiednio 17,5 μg glukozy na minutę i 5,99 mM. Tabela 4 pokazuje, że dodatek frakcji WEAX obniżył obie wartości, co sugeruje, że WEAX hamował aktywność α-glukozydazy w sposób niekompetycyjny. Typową cechą niekompetycyjnej inhibicji jest to, że obie i zmniejszają się w obecności inhibitora. Jest więc prawdopodobne, że frakcje WEAX wiążą się z kompleksem enzym-substrat, zmniejszając w ten sposób zarówno i . Stwierdzono również, że arabinoza hamuje aktywność α-glukozydazy w sposób niekompetycyjny.

Rysunek 2

Kreska Lineweavera-Burka inhibicji α-glukozydazy jelitowej szczura przez arabinoksylan ekstrahowany wodą ().

Nasze wyniki mogą stanowić wyjaśnienie obserwowanej w literaturze niespójności dotyczącej wpływu AX na poposiłkowy poziom glukozy. Karmienie szczurów z cukrzycą typu Zukera chlebem suplementowanym AX (Ara/Xyl = 0,9) powodowało istotne obniżenie poposiłkowego stężenia glukozy we krwi. W przeciwieństwie do tego, spożycie rodzimego AX (Ara/Xyl = 0,5) nie miało wpływu na odpowiedź glukozy we krwi. Również suplementacja diety 6 i 12 g AX (Ara/Xyl = 0,66 lub 0,8) obniżyła stężenie glukozy we krwi zarówno u osób zdrowych, jak i chorych na cukrzycę. Jednakże AX (Ara/Xyl = 0,8) nie zmniejszał poposiłkowej odpowiedzi glukozy u zdrowych dorosłych ludzi. Świnie karmione białym chlebem z dodatkiem AX miały zmniejszony strumień glukozy netto w porównaniu do świń karmionych białym chlebem. Brak szczegółowego składu chemicznego i struktury utrudnia porównanie wyników dotyczących skuteczności AX . Tak więc, nawet jeśli stężenie użytych AX może być takie samo, jego skuteczność będzie zależała od rodzaju użytych AX. Wykazaliśmy, że AX otrzymane przy 50% nasyceniu siarczanem amonu wykazywały wyższą siłę hamowania w porównaniu z AX otrzymanymi przy 75%.

4. Wnioski

Wyniki badań wskazują, że antyglikemiczne działanie arabinoksylanów może wynikać z hamowania aktywności jelitowej α-glukozydazy, ale nie amylazy. Na siłę działania wodnej ekstrahowalnej AX na aktywność α-glukozydazy wpływała zawartość kwasu ferulowego, stosunek arabinozy do ksylozy oraz sposób podstawienia ksylozy. Wyniki badań sugerują również, że hamowanie aktywności α-glukozydazy odbywa się poprzez mechanizm niekompetycyjny. W związku z tym spożywanie diety bogatej w ekstrahowalne w wodzie AX może łagodzić poposiłkowy poziom glukozy we krwi.

Ujawnienie

Część wyników została przedstawiona jako plakat ustny na sympozjum Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP)/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB), które odbyło się w St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre od 20 do 22 kwietnia 2016 roku.

Konflikty interesów

Wszystkie otrzymane fundusze lub wsparcie materialne nie prowadziły do konfliktu interesów w publikacji tego manuskryptu.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) poprzez Discovery Grant Programme. Autorzy są również wdzięczni firmie Cargill Limited za dostarczenie próbek aleuronu pszenicy oraz Ce Zhou, Alison Ser i Pat Kenyon z Wydziału Nauk o Żywności, University of Manitoba, za ich wsparcie techniczne.