Asymetryczna synteza batrachotoksyny: Enantiomeric toxins show functional divergence against NaV

Fenotypowe efekty ostrych trucizn znalezionych wśród bogatej farmakopei życia lądowego i morskiego zostały udokumentowane od starożytności. Izolacja i charakterystyka związków toksycznych udostępniła ważne odczynniki chemiczne do badania złożonych układów biochemicznych (1). Badania tego typu ujawniły dużą liczbę peptydowych i drobnocząsteczkowych środków, które celują w napięciowo bramkowane sodowe kanały jonowe (NaVs), klasę białek błonowych niezbędnych do sygnalizacji bioelektrycznej (1-4). Wśród zbioru znanych modulatorów NaV znajdują się trzy strukturalnie pokrewne środki, (-)-batrachotoksyna, weratrydyna i akonityna (ryc. 1A) – duże, lipofilowe pochodne aminowe, które prawdopodobnie mają wspólne miejsce wiązania w wewnętrznym regionie porów NaV (3) (miejsce 2, ryc. 1B). Wpływ tych toksyn na bramkowanie jonowe różni się jednak wyraźnie. Z jednej strony, (-)-BTX, podstawowy toksyczny składnik kolumbijskich żab z gatunku Phyllobates, jest pełnym agonistą NaV, powodując łatwiejsze otwieranie kanału przy hiperpolaryzowanych potencjałach błonowych i blokując szybką inaktywację (wśród innych charakterystycznych efektów) (3-5). I odwrotnie, aktywność weratrydyny i akonityny najlepiej opisać jako częściowy agonizm i hamowanie funkcji kanału, odpowiednio (5). Pomimo niedawnego wglądu biologii strukturalnej w trójwymiarową architekturę prokariotycznych NaVs (6-9), brakuje molekularnego zrozumienia wpływu toksyn z miejsca 2 na przewodnictwo jonowe i kinetykę bramkowania jonów. Badania struktury-aktywności toksyn, w połączeniu z eksperymentami mutagenezy białek, mogą odpowiedzieć na pytania związane z dynamiczną naturą funkcji kanałów i mogą prowadzić do racjonalnego projektowania małomolekularnych modulatorów aktywności NaV (1). Siła działania (-)-BTX (10), jego historia jako archetypowej małomolekularnej sondy miejsca 2 (4) i jego niezrównany wpływ na bramkowanie kanału czynią go optymalnym „wiodącym” związkiem do takich badań.

(-)-BTX wiążąc się z NaVs zmienia każdy aspekt funkcji kanału, powodując hiperpolaryzacyjne przesunięcie w napięciowej zależności aktywacji, hamowanie zarówno szybkiej jak i wolnej inaktywacji, zmniejszenie przewodnictwa pojedynczego kanału oraz zmniejszenie selektywności jonowej (3, 4). Użyteczność tego naturalnego produktu jako aktywatora NaV doprowadziła do znacznego uszczuplenia światowych zasobów, które kiedyś przekraczały 1 g, ale w 2009 roku wynosiły mniej niż 170 mg (11, 12). Od czasu, gdy toksyna została po raz pierwszy wyizolowana w 1963 roku przez Märki i Witkopa z trujących żab zebranych w północnych lasach deszczowych Kolumbii (13), Phyllobates został umieszczony na liście gatunków zagrożonych, a tym samym zbieranie naturalnego (-)-BTX z tego źródła jest ograniczone. (-)-BTX został również zidentyfikowany u wybranych gatunków ptaków (rodzaj Pitohui i Ifrita) (14) i chrząszczy (rodzaj Choresine) (15), ale tylko w małych ilościach (np. ~1,8 μg (-)-BTX na chrząszcza). Chociaż ujawniono półsyntezy (16) i syntezy racemiczne (17) BTX-A (Rys. 1C), związku pozbawionego estru pirolowego C-20, długość każdej z tych prac (>45 kroków liniowych) wyklucza łatwą produkcję (-)-BTX lub wybranych analogów. W związku z tym nasze pragnienie wykorzystania BTX i jego zmodyfikowanych form do badania dynamiki kanałów i mechanizmów bramkowania jonów zmotywowało nas do podjęcia wysiłków w celu uzyskania produktu naturalnego w drodze syntezy de novo.

Retrosyntetyczna analiza (-)-BTX doprowadziła nas do nakreślenia planu, który umożliwiłby późne złożenie pierścienia homomorfoliny E i opracowanie estru allilowego C-20 (ryc. 1C), ułatwiając w ten sposób dostęp do zmodyfikowanych form toksyny. Wcześniejsze badania zależności struktura-aktywność z wykorzystaniem niewielkiej liczby półsyntetycznych pochodnych BTX (10, 18) i analogów BTX z pierścieniem C/D/E (19) ujawniły znaczenie estru C-20, trzeciorzędowej aminy i szkieletu tetracyklicznego dla aktywności agonistycznej NaV. Rozszyfrowanie BTX-A odsłania steroidopodobną ramę 1, której złożenie jest utrudnione przez dwie grupy kątowe na złączu C/D-ring, egzo-metylen C-11 i alken C-8/C-9. Aby zmaksymalizować zbieżność w naszym planie syntetycznym, opracowaliśmy strategię rozłączania 1 w poprzek pierścienia C. Pomysł ten zredukowałby problem konstruowania 1 do dwóch fragmentów, jednego wyrażającego układ pierścieni A/B (3, 20) i drugiego zawierającego cyklopentan z pierścieniem D (4, 21). Pomyślne wykonanie tego schematu mogłoby wytworzyć pożądaną toksynę poprzez sekwencję liniowych kroków o łącznej długości nie większej niż 20 do 25.

Nasza synteza (-)-BTX rozpoczęła się od sprzężenia metylenocyklopentanonu 4 (21) (rys. S1A) i bromku winylu 3, otrzymanego z (S)-(+)- ketonu Hajosa-Parrisha poprzez zmodyfikowaną sekwencję kroków pierwotnie nakreśloną przez Parsonsa i współpracowników (20) (rys. S1B). Połączenie fragmentów 3 i 4 w celu wytworzenia połączonego trójcyklu A/B/D 5 stanowiło pierwsze z serii wyzwań związanych z rozwojem procesu. Początkowa próba przeprowadzenia tej transformacji obejmowała wymianę Li-Br fragmentu 3 z n-BuLi (Bu, butyl) i sekwencyjne dodanie enonu 4. Mimo, że w tych warunkach udało się otrzymać 5, wydajność produktu nigdy nie przekroczyła 30%. Eksperymenty z wygaszaniem deuteru za pomocą D2O potwierdziły naszą hipotezę, że α-deprotonacja 4 jest konkurencyjna w stosunku do pożądanej ścieżki addycji ketonu. Zbadano reakcje transmetalacji winylolitów z ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, etyl), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, trifluorometanosulfonian), CeCl3-2LiCl i LaCl3-2LiCl, ale żaden z tych środków nie okazał się skuteczny (22, 23). Dodanie jednego równoważnika bezwodnego LiBr do nośnika reakcji 3 poprawiło wydajność sprzęgania o >20% (24). Idąc tym tropem, zoptymalizowany protokół wykorzystujący 2,1 równoważnika t-BuLi, który przypuszczalnie generuje jeden równoważnik LiBr in situ, powtarzalnie pozwolił na otrzymanie 5 jako pojedynczego diastereomeru z wydajnością 65% w skali wielogigramowej. Łatwość syntezy tego materiału i jego zdesililowanej formy 6 umożliwiła późniejsze próby identyfikacji warunków dla tandemowej annulacji pierścienia C i instalacji czwartorzędowego centrum C-13.

Ocena dostępnych metod zamykania pierścienia 1,6-enyn doprowadziła nas do rozważenia procesów inicjowanych rodnikami (25). W takich warunkach, rozpoczynający się rodnik C-13 3° mógłby zostać przechwycony w celu wykucia kątowej jednostki aminometylenowej (lub odpowiedniego substytutu). Próby zbadania tworzenia się pierścienia C na 6 ujawniły jednak potencjalne niepowodzenie tego planu. Użycie n-Bu3SnH i trietyloboranu (Et3B) do promowania cyklizacji spowodowało wygenerowanie dwóch izomerów, 7 i 8, w stosunku 1:5 faworyzującym niepożądany produkt (Rys. 2A). Badania przeprowadzone przez Stork’a oraz Beckwith’a i współpracowników wykazały, że stężenie substratu i temperatura reakcji mogą wpływać na sposób cyklizacji (tj. 5-exo-trig versus 6-endo-trig) w reakcjach enynowych prowadzonych z udziałem rodników (26, 27). W podwyższonej temperaturze (130°C) i przy pięciokrotnym rozcieńczeniu 6, zaobserwowano odwrócenie selektywności, dając niewielki nadmiar pożądanego tetracyklu (stosunek 1,3:1 7 do 8; Rys. 2A). Łączna wydajność produktu tej transformacji przekroczyła 90%, zachęcając tym samym do dalszych badań tej chemii, pomimo skromnych wyników selektywności.

Powtarzane próby wychwycenia pośredniego rodnika C-13 za pomocą pochodnych oksymu i hydrazonu generowanych z formaldehydu nie przyniosły oczekiwanego produktu aminometylacji (28). Zmuszeni do rozważenia alternatywnych rozwiązań, uznaliśmy, że zmodyfikowana grupa eteru sililowego dołączona z sąsiedniego alkoholu C-14 będzie trafnie umiejscowiona, aby przechwycić rodnik 3° (29). W oparciu o dostępne precedensy, do modyfikacji alkoholu C-14 w 6 wybrano chlorek alkilosililowy, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, metyl) (30, Rys. 2A). Poddanie powstałego eteru sylikonowego (9) działaniu n-Bu3SnH i Et3B w temp. 150°C spowodowało kaskadę cyklizacji, w wyniku której otrzymano pentacyl 10 jako produkt wyłączny (31). W granicach detekcji protonowego magnetycznego rezonansu jądrowego (1H NMR), żaden z odpowiednich pięcioczłonowych izomerów pierścienia C nie został wygenerowany w tym procesie. Nasze wstępne wysiłki zmierzające do zrozumienia roli podstawników C-14 na selektywność reakcji sugerują, że sililowa ochrona alkoholu (wraz z podwyższoną temperaturą reakcji) sprzyja zamykaniu pierścienia 6-endo-trig. Chociaż dodatkowe badania są uzasadnione, aby docenić te dane dotyczące selektywności strukturalnej, nasza kaskada cyklizacji enyny oferuje konwergentne podejście do syntezy podstawionych rusztowań steroidowych i powinna ułatwić dostęp do szerokiej gamy takich związków.

Bliska inspekcja produktów cyklizacji rodnikowej otrzymanych z 6 lub 9 ujawniła nieoczekiwany wynik odnoszący się do struktury powstałej cząsteczki organostannanu (Rys. 2, A i B). Karbostanilowanie grupy alkinowej powinno dawać produkt winylo-cynowy, jak zauważono w reakcji 6. Nieoczekiwanie, gdy 9 poddano tym samym warunkom reakcji, jedynym produktem był allilostannan 10, co potwierdzono zarówno metodą NMR, jak i krystalografii rentgenowskiej. Tworzenie allilostannanu 10 można uzasadnić mechanizmem obejmującym przeniesienie atomu 1,4-H z pośredniego rodnika winylowego (32) (Rys. 2B), propozycja ta jest poparta eksperymentem ze znakowaniem deuterem (Rys. S5). Chociaż ten wynik był nieplanowany, wydajność i selektywność reakcji cyklizacji zmusiła nas do podjęcia decyzji o rozwoju tego materiału. Patrząc w przyszłość, wszechstronność grupy allilostannanowej powinna służyć przyszłym wysiłkom w celu przygotowania BTX modyfikowanych pierścieniem C.

Dostępność 10 w dziewięciu krokach z ketonu Hajosa-Parrisha umożliwiła produkcję znacznych ilości materiału do ukończenia docelowej syntezy. Wydzielenie pomostowego eteru sililowego w 10 przeprowadzono z nadmiarem n-Bu4NF, odsłaniając pośredni diol, który następnie został rozwinięty do 11 poprzez utlenianie alkoholem pod wpływem kwasu 2-jodoksybenzoesowego i chemoselektywne rozszczepienie winylosilanu (57%; Rys. 2B). Konwersję aldehydu 11 do chloroacetamidu 12 przeprowadzono zgodnie z trzystopniową sekwencją w pojedynczej kolbie (16, 33). Z 12, wydajne zamknięcie pierścienia homomorfolinamidowego za pomocą NaOEt (92%) (17) dostarczyło uniwersalnego półproduktu do modyfikacji zarówno jednostek pierścienia C jak i D. To ostatnie można było osiągnąć za pomocą triflanu enolu pierścienia D, przygotowanego przy użyciu KN(SiMe3)2 i PhNTf2.

Introdukcja alkoholu C-11α z pierścienia C allilostannanu 13 stanowiła jedno z trudniejszych wyzwań w naszym podejściu do BTX (Rys. 2B). Chociaż protodestanilowanie 13 w celu wygenerowania odpowiadającego C-11 egzo-metylenecykloheksanu zakończyło się ograniczonym sukcesem (34), wszystkie kolejne próby utlenienia tego związku do ketonu 15 (tj. O3, OsO4 i RuO4) nie dały produktu. Zainspirowani raportem Kima i Fuchsa, podjęliśmy próbę konwersji 13 do odpowiedniego chlorku allilu przy użyciu CuCl2 (35). Szczęśliwie, przeprowadzenie tej reakcji w dioksanie w warunkach tlenowych dało enal 14 z wydajnością 85% i tylko niewielką ilością chlorowanego produktu (~10%). Chociaż szczegóły mechanistyczne tej transformacji pozostają niejasne, jesteśmy świadomi tylko jednego innego udokumentowanego przykładu takiej reakcji utleniania, która wykorzystuje katalizator wanadowy i O2 (36). Enal 14 jest odpowiednio przygotowany do konwersji do C-11 ketonu 15 poprzez serię kroków konwersji grup funkcyjnych, podkreślonych przez rearanżację Curtiusa (37). Brak trwałego chromoforu na batrachotoksynie A (BTX-A) utrudnia oczyszczanie tego materiału; odpowiednio, w sekwencji prowadzącej do 15, C-3 metoksyacetal został wymieniony na alkohol p-metoksyfenetylowy.

Kompletację szkieletu węglowego (-)-BTX przeprowadzono poprzez katalizowane palladem sprzęganie krzyżowe tributylo(1-etoksy-winylo)cyny z triflatem winylu 15 (Rys. 3A) (38). Hydroliza in situ powstałego eteru enolowego za pomocą 1 M kwasu szczawiowego dostarczyła enonu 16 (77%). Po szeroko zakrojonym poszukiwaniu środków redukujących, udało się przeprowadzić stereoselektywną globalną redukcję enonu 16 z wydajnością 33% poprzez traktowanie go świeżo przygotowanym AlH3 (39). Postawiliśmy hipotezę, że zasadowy laktam Lewisa (lub jego zredukowana forma) działa jako kluczowy element stereokontrolujący, ponieważ traktowanie enonu 15 alternatywnymi reduktorami wodorkowymi dostarczyło wyłącznie niepożądanego alkoholu C-11β. Zastosowanie AlH3 również sprzyjało generowaniu prawidłowego epimeru alkoholu allilowego C-20, co jest wynikiem sterochemicznym, który może być racjonalnie uzasadniony poprzez model odwołujący się do kontroli chelatowej (38). Deprotekcja produktu redukcji AlH3 w warunkach kwaśnych pozwoliła na otrzymanie (-)-BTX-A z 83% wydajnością (17). Wreszcie, stosując modyfikację protokołu acylowania (-)-BTX-A Tokuyamy, Daly’ego i Witkopa za pomocą mieszanego bezwodnika przygotowanego z chloroformanu etylu i kwasu 2,4-dimetylopirolo-3-karboksylowego (10), ukończono syntezę 2 mg (-)-BTX (79%, wydajność ogólna 0,25%) w 24 etapach z (S)-(+)- ketonu Hajosa-Parisha. Produkt był identyczny pod każdym względem z próbką materiału naturalnego oraz z wcześniej zarejestrowanymi danymi spektroskopowymi (40, 41). Nasz plan syntetyczny umożliwił również otrzymanie w skali miligramowej antypody nienaturalnej toksyny, (+)-BTX, znanego estru benzoesanowego (-)-BTX-A (BTX-B; Rys. 3B) (42, 43) oraz enancjomeru tego związku (ent-BTX-B).

Elektrofizjologiczna charakterystyka syntetycznych (-)-BTX i BTX-B wobec szczurzego NaV1.4 (rNaV1.4) potwierdziła, że ten ostatni również funkcjonuje jako agonista i jest podobny w sile działania do produktu naturalnego (fig. S6 i tabela S12). Wcześniejsze doniesienia oraz badania własne wskazują, że grupa estrowa BTX-B jest bardziej stabilna niż wrażliwy na utlenianie acylopirol BTX, dlatego dodatkowe doświadczenia przeprowadzono z tym pierwszym związkiem (42, 43). Syntetyczny BTX-B był testowany przeciwko podzbiorowi reprezentatywnych izoform NaV, w tym rNaV1.4, ludzkiemu NaV1.5 i ludzkiemu NaV1.7. Podanie 10 μM BTX-B do komórek jajnika chomika chińskiego, wykazujących ekspresję jednego podtypu NaV, powodowało we wszystkich przypadkach utrzymywanie się prądu sodowego (ryc. 4A i fig. S7 i S8). Zależny od użycia agonizm izoform NaV przez BTX-B zapobiegał inaktywacji w stanie stacjonarnym >80% populacji kanałów sodowych (Figura 4A i figura S8). BTX-B wywołał również charakterystyczne hiperpolaryzujące przesunięcie (-44,9 do -51,5 mV) w pół-maksymalnym napięciu (V0,5) aktywacji izoform NaV typu dzikiego (Figura 4B i tabela S13). Podobieństwo tych danych jest zgodne z wysoką konserwacją sekwencji białek między podtypami NaV w wewnętrznych, wyściełających pory heliksach S6, które tworzą putatywne miejsce wiązania toksyny (fig. S9).

Podążając za wcześniejszą pracą z naszego laboratorium (19) i innych (44, 45), zastanawialiśmy się, czy enancjomeryczna forma BTX wiązałaby się z wysokim powinowactwem do NaV z analogicznymi efektami funkcjonalnymi. Odpowiedź na to pytanie może być udzielona jedynie w przypadku dostępności syntezy de novo toksyny. W związku z tym przeprowadzono zapisy elektrofizjologiczne z ent-BTX-B wobec rNaV1.4. Dane te ujawniły, że ent-BTX-B jest antagonistą kanału zależnym od użycia i stanu, z mierzonym pół-maksymalnym stężeniem hamującym wynoszącym 5,3 ± 0,6 μM . Stężenie dla pół-maksymalnego hamowania NaV przez ent-BTX-B jest podobne pod względem wielkości do pół-maksymalnego efektywnego stężenia dla agonizmu BTX-B (1,0 ± 0,1 μM; fig. S10) mierzonego w identycznych warunkach. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do naturalnej antypody, wiązanie ent-BTX-B spowodowało tylko minimalne przesunięcie V0,5 aktywacji i V0,5 inaktywacji w stanie ustalonym (tabela S14). Ponadto blok kanału był całkowicie odwracalny przez ten inhibitor.

Aby ustalić, czy BTX-B i ent-BTX-B mają nakładające się miejsce wiązania w wewnętrznym regionie porów NaV, ent-BTX-B przetestowano przeciwko pięciu mutacjom jednopunktowym rNaV1.4, które wcześniej wykazano, że destabilizują wiązanie BTX (ryc. 4, E i F, i fig. S12) (19). Mutacja N434 (46), L1280 (47), F1579 (48) i N1584 (48) do lizyny spowodowała ~3- do 30-krotne zmniejszenie bloku prądu przez 5 μM ent-BTX-B. Natomiast wobec F1236K (49), ent-BTX-B zachował znaczącą aktywność (33,6 ± 2,1% inhibicji prądu). Wyraźna różnica pomiędzy ent-BTX-B i BTX-B wskazuje na nakładający się, ale nieidentyczny region wiązania w obrębie wewnętrznej jamy porów. Wydaje się, że otwarty kanał jest wystarczająco duży, aby pomieścić lipofilowe ligandy trzeciorzędowe aminowe (19, 45, 50). Subtelne zmiany w pozycji wiązania tych ligandów wydają się drastycznie zmieniać funkcjonalną odpowiedź białka. Przyszłe badania będą ukierunkowane na określenie dokładnych interakcji kanał-toksyna, które odróżniają aktywację od inhibicji przez pochodne BTX i pokrewne toksyny lipofilowe.