Basidiospore

Wzrost w wodzie z ekstraktem glukozowo-drożdżowym-peptonowym: Po 3 dniach w 18°C komórki są kuliste do jajowatych, 3-10×5-13 μm, z małymi kapsułkami. Komórki występują pojedynczo, parami lub czasami w krótkich łańcuszkach (ryc. 134.2). Może być obecna cienka pełzająca otoczka. Po 1 miesiącu może być obecny osad, pierścień i czasami wysepki.

Ryc. 134.2. Xanthophyllomyces dendrorhous szczep UCD 67-385. Skaningowy mikrograf elektronowy komórek hodowanych przez 24 godziny na agarze YM w 20°C.

Fotografia autorstwa C. Echavarri-Erasun.

Formacja podstawczaków: Bazidiospory można zaobserwować po 2-3 tygodniach w 18°C na podłożach agarowych zawierających poliole (rybitol, d-glucitol, l-arabitol lub d-ksylitol) i pentozy (d-rybozę, d-ksylozę lub d-arabinozę). Po koniugacji między komórką a jej pączkiem powstaje smukłe, cylindryczne holobasidium o średnicy 2-3 μm i długości 30-165 μm (zwykle 70-80 μm) (ryc. 134.3). Rzadko dochodzi do koniugacji pomiędzy niezależnymi komórkami, rzadko też tworzy się basidium bez widocznej koniugacji. Na terminalnym wierzchołku bazidium powstają zwykle trzy do czterech (do sześciu) cienkościennych, owalnych lub elipsoidalnych zarodników o wymiarach 3-6×5-12 μm. Bazidiospory występują na krótkich bazidioforach i kiełkują przez pączkowanie. Balistospory nie są wytwarzane.

Ryc. 134.3. Xanthophyllomyces dendrorhous CBS 9090. Wydłużone bazidium powstałe w wyniku kojarzenia komórek i pączków po 2 tygodniach w 18°C na podłożu poliolowym. Terminalne bazidiofory występują na krótkich bazidioporach.

Fotografia N. Pinel.

Fermentacja

.

Glukoza	ws
Galaktoza	–
Sukroza	+/ws
Maltoza	-/ws
Laktoza	–
Rafinoza	w/-
Trehaloza	w

Wzrost (w ciekłych mediach)

.

.

.

Glukoza	+
Inulina	w/-
Sukroza	+/-1
rafinoza	+/s
melibioza	–
Galaktoza	–
Laktoza	–
Trehaloza	+
Maltoza	+
Melezitoza	+
Metylo-α-d-glukozyd	w/-
Skrobia rozpuszczalna	+
Celobioza	+
Salicyna	v
l-.Sorboza	-/w
l-.Ramnoza	–
d-Xyloza	+/s
l-Arabinoza	+
d-Arabinoza	–
d-Ryboza	w/-
Metanol	–
Etanol	s/+
Glicerol	s/w
Erytrytol	–
Ribitol	w/-
Galaktitol	–
d-.Mannitol	+/-1
d-Glucytol	-/s
myo-Inozytol	–
dl-.Mleczan	v
Succinate	+/s
Citrate	+/-1
d-Gluconate	+/s
d-Glukozamina	–
N-Acetylo-d-glukozamina	–
Heksadekan	–
Nitrat	–
Witamina-wolna	–

1 CBS 9090 wykazał negatywną odpowiedź na te związki.

Dodatkowe testy wzrostu i inne cechy charakterystyczne

.

ksylitol	w/-
2-Keto-d-glukonian	+
5-Keto-d-glukonian	w
d-Glukuronian	v
Arbutyna	+
l-Arabinitol	w/-
d-Glucono-1,5,-lakton	v
d-Galakturonian	v
Butan 2.3, diol	–
Propan 1,2 diol	w/-
d-Glukaran	w/-
d-Galaktonian	w/-
Nitryna	–
Lizyna	+/w
Kadaweryna	+/-1
Kreatyna	–
Glukozamina	–
Imidazol	–
d-…Tryptofan	+/w
10% NaCl/5% glukoza	–
50% glukoza medium	w
Tworzenie skrobi	+
DBB	+
Upłynnianie żelatyny	w
Wzrost w 25°C	+
Wzrost w 30°C	–

1 CBS 9090 wykazał negatywną odpowiedź na ten związek.

CoQ: 10 (Sugiyama i wsp. 1985).

Mol% G+C: 48,3 (BD: Miller i wsp. 1976b).

Węglowodany komórkowe: Mannoza, ksyloza, glukoza, galaktoza i ramnoza są obecne w hydrolizatach całokomórkowych (Johnson et al. 1978).

Typ szczepu: CBS 7918.

Pochodzenie badanych szczepów: Dane podane w powyższym opisie standardowym zostały opracowane na podstawie szczepu typu CBS 7918, który został wyizolowany przez Golubeva (1995) ze strumienia brzozy srebrzystej (Betula pendula) w regionie moskiewskim w Rosji oraz ze strony internetowej CBS dla szczepów CBS 5905, który jest szczepem typu Phaffia rhodozyma, wyizolowanym z buka japońskiego (Fagus crenata) w Japonii (Phaff i in. 1972); CBS 5908, z olszy japońskiej (Alnus japonica) w Japonii (Phaff et al. 1972); CBS 6938, z pniaka Betula sp. w Finlandii zebranego przez O. Turpeinen w Finlandii, maj 1977 (Golubev 1998b); CBS 7919, z brzozy białej (Betula tauschii) w Japonii (Phaff et al. 1972) oraz CBS 9090, który przypuszczalnie pochodzi z tego samego źródła co CBS 5905 (Fell et al. 2007). Szczepy te, oraz dodatkowe izolaty, zostały zbadane na podstawie analiz filogenetycznych (Fell et al. 2007, patrz poniżej: „Systematyka”).

Systematyka: Xanthophyllomyces jest członkiem gromady Cystofilobasidiales. Xanthophyllomyces ma charakterystyczny płciowy cykl rozrodczy wśród Cystofilobasidiales i wśród drożdży bazidiomycetous, w ogóle. Cykl ten jest homokariotyczny poprzez kojarzenie się komórki i pączka. Wytwarza się wydłużone holobasidium, a podstawczaki powstają terminalnie na miniaturowych kołeczkach. Terminalne powstawanie podstawczaków na holometabasidiach jest obecne u Cystofilobasidiales (patrz Cystofilobasidium capitatum). Natomiast cykl płciowy u C. capitatum, i innych członków Cystofilobasidiales, obejmuje tworzenie teliospor, cecha, która nie występuje u Xanthophyllomyces.

Ekologia: Xanthophyllomyces dendrorhous został wyizolowany z soków drzew w regionach o umiarkowanym klimacie na półkuli północnej i południowej. Siedliska te obejmują olszę japońską (Alnus japonica) w Japonii (Phaff et al. 1972), gnijący pień brzozy (Betula sp.) w Finlandii (Golubev 1998b), brzozę papierową (Betula papyrifera) na Alasce, brzozę białą (B. tauschii) w Japonii (Phaff et al. 1972), brzozę szarą (B. populifolia) w Wisconsin i Illinois, USA (uzyskane przez C.P. Kurtzmana jak podano w Fell et al. 2007), brzoza srebrna (B. pendula) w Rosji (Golubev 1995) i gnijące pniaki w Kaiserslautern, Niemcy (Weber et al. 2006), dogwood (Cornus brachypoda) w Japonii (Phaff et al. 1972), buk japoński (Fagus crenata) w Japonii (Phaff et al. 1972) i buk południowy (Nothofagus sp.) w Argentynie (Libkind et al. 2007). W tym ostatnim badaniu odnotowano występowanie X. dendrorhous w połączeniu z owocnikami ascomycete Cyttaria hariotti, która jest pasożytem buka południowego. Ostatnio szczep Xanthophyllomyces (MIC-CONC-2006-762) został wyizolowany przez Webera i wsp. (2008) z liścia gumowca tasmańskiego (Eucalyptus globules) rosnącego w klimacie śródziemnomorskim w Concepción, Chile. Autorzy podali, że szczep ten nie grupował się z kompleksem X. dendrorhous (w tym Phaffia rhodozyma) w analizach filogenetycznych ITS i LSU rRNA. Szczep ten różnił się także od innych szczepów Xanthophyllomyces zdolnością do wzrostu w temperaturze 28°C, w przeciwieństwie do typowej maksymalnej temperatury wzrostu 25°C. Niebieska guma pochodzi z Tasmanii i Australii i jest eksportowana na cały świat, ze względu na jej wartość w produkcji drewna. Badanie szczepów Xanthophyllomyces związanych z ogólnoświatową dystrybucją drzewa niebieskiej gumy mogłoby dostarczyć interesujących informacji ekologicznych i filogenetycznych.

Biotechnologia: Xanthophyllomyces dendrorhous ma wartość w biotechnologii jako źródło astaksantyny, głównie dla marikultury (Johnson i Schroeder 1995). Wczesne badania nad łososiowatymi i karmieniem zwierząt, które wykazały skuteczność jako źródła pigmentu, przeprowadzono z Phaffia rhodozyma (patrz Rozdział 152). Następnie, szczepy X. dendrorhous, które produkują wysoki poziom astaksantyny, zostały opracowane do produkcji komercyjnej. Większość mutantów została wyizolowana przez losową mutagenezę i badania przesiewowe z powodu braku wiedzy na temat genetyki gatunku. Metody zostały opracowane do izolacji hiper-producent mutantów, takich jak selekcja antimycin-agar, zastosowanie cytometrii przepływowej i sortowania komórek (An et al. 1989, 1991), a warunki dla zwiększonej syntezy karotenoidów podczas wzrostu (Gu et al. 1997, Schroeder i Johnson 1995, Schroeder et al. 1996).

Skoro biosynteza karotenoidów jest jedną z wybitnych cech X. dendrorhous, to został zbadany w niektórych szczegółach. Około 85% stanowi astaksantyna z niewielkimi ilościami β-karotenu i innych karotenoidów (Andrewes et al. 1976). Astaksantyna z P. rhodozyma, i przypuszczalnie w X. dendrorhous, ma konfigurację 3R, 3R’-, przeciwną do astaksantyny z innych źródeł dotychczas zbadanych (Andrewes i Starr 1976). Zawartość i ilość karotenoidów jest bardzo zróżnicowana, co zależy od szczepu i warunków hodowli. Produkcja karotenoidów jest wyraźnie stymulowana przez tlen i pochodne reaktywne formy tlenu (An et al. 1989, Johnson i Lewis 1979, Schroeder et al. 1985). Wyizolowano wiele mutantów tworzących karotenoidy, które nadają wzrostowi na agarze różne kolory, w tym biały, żółty i głęboko pomarańczowo-czerwony (Johnson 2003). Tworzenie karotenoidów i atrakcyjny kolor drożdży stanowią doskonałe narzędzie dydaktyczne w biologii drożdży (Weber i Davoli 2003).

Biosynteza różnych karotenoidów u X. dendrorhous i P. rhodozyma jest słabo poznana. Wyizolowano i zsekwencjonowano geny prowadzące do β-karotenu (Visser et al. 2003). W 1989 roku zaproponowano, że enzymy cytochromu P-450 są odpowiedzialne za konwersję β-karotenu do astaksantyny (An et al. 1989), ale dopiero w 2006 roku wyizolowano gen kodujący cytochrom P-450 z ludzkiej podrodziny 3A, którego przypuszczalną funkcją jest konwersja β-karotenu. Wprowadzenie tego genu do mutanta β-karotenu wyizolowanego przez An et al. (1989) przywróciło biosyntezę astaksantyny (Ojima et al. 2006). Jednak pełne udowodnienie, że ten produkt genu jest wyłącznie odpowiedzialny za konwersję β-karotenu do astaksantyny będzie wymagało dodatkowych badań, w tym oczyszczenia i scharakteryzowania enzymu(ów). Do tej pory nie przeprowadzono analizy enzymów do biosyntezy karotenoidów, co wynika głównie z ich lipofilnej natury i błonowej lokalizacji, braku komercyjnie dostępnych substratów karotenoidowych w szlaku biosyntezy oraz prawdopodobieństwa powolnej aktywności katalitycznej.

W innych badaniach, X. dendrorhous został zgłoszony do produkcji trisacharydu, neokestozy, z potencjalną aktywnością probiotyczną (Kritzinger et al. 2003). Niedawno z X. dendrorhous wyizolowano α-glukozydazę o aktywności amylolitycznej (Marín et al. 2006), co potwierdza zdolność drożdży do wzrostu na maltozie.

Podstawowym środowiskiem X. dendrorhous i P. rhodozyma są strumienie śluzu drzew liściastych w północnych szerokościach geograficznych i na dużych wysokościach. W tym siedlisku funkcją karotenoidów w drożdżach jest prawdopodobnie zapewnienie ochrony przed fotogenerowanymi substancjami przeciwgrzybicznymi w strumieniu drzew, takimi jak reaktywne formy tlenu, w tym tlen singletowy, nadtlenek wodoru i ozon (Schroeder i Johnson 1995). Ekspozycja na światło wpływa również na wzrost i tworzenie karotenoidów u X. dendrorhous (An i Johnson 1990). Schroeder i Johnson (1993a,b, 1995) wykazali, że podstawową funkcją fizjologiczną karotenoidów w X. dendrorhous jest ochrona przed zabijaniem przez reaktywne formy tlenu. X. dendrorhous jest często izolowany ze śluzowców, drzew liściastych lub w towarzystwie innych grzybów i można się spodziewać, że zachodzą między nimi interakcje. Echavarri-Erasun i Johnson (2004) stwierdzili, że na wzrost i tworzenie astaksantyny w X. dendrorhous miał wpływ Ascomycete Epicoccum nigrum i wolne od komórek ekstrakty z tego grzyba. W jednym z przykładów interakcji między grzybami, szczepy X. dendrorhous zostały zgłoszone do degradacji, w warunkach laboratoryjnych, ochratoksyny (Péteri et al. 2007), która jest toksyną produkowaną przez gatunki Aspergillus i Penicillium. Dalsze badania ekologii X. dendrorhous i interakcji w obrębie konsorcjów mikrobiologicznych doprowadziłyby do lepszego poznania biologii drożdży.

Rolnictwo i żywność: Astaksantyna jest produkowana komercyjnie jako suplement paszowy, głównie dla akwakultury łososiowatych. Barwnik ten może ostatecznie znaleźć zastosowanie na innych rynkach paszowych dla mięsa drobiowego, jaj kurzych, skorupiaków i ptaków egzotycznych, takich jak flamingi. Astaksantyna jest delikatną substancją chemiczną, która tradycyjnie była produkowana w drodze całkowitej syntezy chemicznej, ale proces ten wymaga kilku etapów i prowadzi do powstania mieszaniny czterech chiralnych izoform (Johnson i Schroeder 1995). Naturalne formy astaksantyny składają się tylko z jednej chiralnej izoformy, albo 3S, 3S’- lub 3R, 3R’. Naturalne źródła badane pod kątem zastosowań w paszach i żywności obejmują drożdże X. dendrorhous, mikroalgę Haematococcus pluvialis, thraustochytrids oraz ekstrakty z kryla i krewetek, ale ekstrakty z kryla i skorupiaków nie są ekonomicznie opłacalne ze względu na niskie stężenia astaksantyny.

Po identyfikacji astaksantyny w Phaffia rhodozyma przez Andrewes et al. (1976), niektóre amerykańskie, duńskie, holenderskie, szwajcarskie i japońskie firmy rozpoczęły rozwój szczepów do użytku przemysłowego. Szczepy X. dendrorhous zostały opracowane w przemyśle, które produkują 5-15 mg/kg suchej masy drożdży. Haematococcus pluvialis jest również komercyjnym naturalnym źródłem astaksantyny, a w wyspecjalizowanych warunkach hodowlanych alga ta produkuje duże ilości astaksantyny (10-20 mg/g) w cystach. Hodowla tej algi wymaga specjalistycznych i długotrwałych warunków hodowli oraz uwolnienia astaksantyny z cyst. Zaletą X. dendrorhous jest szybki wzrost i wysoki poziom biomasy w kulturze fermentacyjnej (100-150 g drożdży na litr). Jednakże drożdże muszą być hodowane w niskich temperaturach (≤25°C), a dodatkowym problemem przy stosowaniu jako składnik paszy jest to, że gruba ściana komórkowa drożdży musi być przetwarzana przez mechaniczne złamanie, trawienie enzymatyczne lub autolizę, aby umożliwić uwolnienie karotenoidów.

Znaczenie kliniczne: Drożdże nie rosną w temperaturze powyżej 25°C i są uważane za bezpieczne do spożycia przez ludzi. Astaksantyna ma silne właściwości antyoksydacyjne i jest sprzedawana jako suplement diety, który może zapobiegać chorobom zwyrodnieniowym i starzeniu się (Hussein et al. 2006).

.