Z fragmentów DNA, które początkowo próbowaliśmy amplifikować, tylko tlp2, che1P, i cheA1 (Tabela 1) wytworzyły produkt amplifikacji PCR bez użycia dodatków rozpuszczalników, gdy genomowe DNA A. brasilense jako szablonu (Rysunek 1). W pierwszej kolejności przetestowano wpływ DMSO w stężeniach 1.25%, 2.5%, 5.0%, 7.5% i 10% (w/vol) oraz formamidu w podobnych stężeniach jako dodatków do PCR (Rysunek 1). Zestaw PCR przeprowadzono również z BSA w stężeniu 1-10 μg/μl (dane nie pokazane). Zgodnie z danymi literaturowymi, podczas gdy zarówno dodatek DMSO jak i formamidu w PCR promował wzrost wydajności amplifikacji fragmentów DNA o wielkości 2-3 kb, efekt wzmacniający DMSO był większy niż formamidu (Rysunek 1). W tych warunkach zaobserwowano również, że zwiększanie stężenia DMSO może również prowadzić do obniżenia specyficzności PCR (Rysunek 2). Z drugiej strony, wpływ formamidu na wzrost wydajności PCR zmniejszał się dla fragmentów DNA większych niż około 2,5 kb (Rysunek 1). W tych warunkach nie zaobserwowano znaczącego efektu dodawania samego BSA jako dodatku do PCR, w tym nie zaobserwowano efektu szkodliwego (dane nie pokazane). Wzmacniający wpływ BSA na wydajność PCR wykryto, gdy był on stosowany w połączeniu z DMSO lub formamidem, w szerokim zakresie rozmiarów fragmentów DNA (rysunek 2). Ponadto, dodatek BSA poszerzał zakres stężeń, dla których rozpuszczalnik organiczny mógł być dodawany, nawet dla szablonów DNA o większych rozmiarach (Figura 2). Konsensus aktualnej literatury dotyczącej formamidu wskazuje, że jest on najbardziej efektywny jako dodatek do PCR, gdy jest stosowany w stężeniach od 0 do 5%, przy czym efektywność ta spada całkowicie przy stężeniu 10%. Nasze wyniki wskazują, że w obecności BSA, formamid jest efektywny przynajmniej do stężenia 10% i z szablonami DNA o rozmiarze do 2,5 kb (tlp2); jednakże nie promował on amplifikacji fragmentów DNA o większych rozmiarach (Rysunek 1). Wynik ten jest zgodny z odnotowanym efektem formamidu jako najbardziej wydajnego dla amplifikacji szablonów DNA do około 2,5 kb i dalej wspiera koncepcję, że DMSO i formamid zwiększają wydajność PCR przez różne mechanizmy. Niezależnie od tych różnic, dodatek BSA do tego PCR wydawał się dalej promować i rozszerzać korzystne efekty zaobserwowane, gdy któryś z dwóch rozpuszczalników był używany jako dodatek do PCR. Biorąc pod uwagę potencjalne negatywne skutki, jakie wysokie stężenia rozpuszczalników organicznych mogą mieć na wrażliwe dalsze zastosowania, takie jak sekwencjonowanie lub klonowanie, wzmacniający efekt dodatku BSA jest znaczący. W celu uzyskania wglądu w to, jak BSA może działać jako czynnik wspomagający z DMSO lub formamidem, przeanalizowaliśmy wpływ jego dodatku na wydajność amplifikacji w 10, 15, 20, 25 i 30 cyklach PCR. Analiza ta potwierdziła, że dodanie DMSO lub formamidu, ale nie samego BSA, do PCR prowadzi do wzrostu wydajności (Rysunek 3). Kiedy BSA był używany jako ko-enhancer z DMSO lub formamidem, wzrost wydajności można było wykryć tylko w pierwszych 15 cyklach dla wszystkich szablonów (Rysunek 3). Wzrost ten wynosił od 10,5% (che1P) do 22,7% (cheA1) w ciągu pierwszych 15 cykli. Ponadto stwierdzono, że efektywne stężenie BSA wzrasta wraz z wielkością amplifikowanego fragmentu DNA, aż do maksymalnego stężenia BSA (10 μg/μl), przy którym nie stwierdzono dalszego wzrostu wydajności. Ponadto, nie zaobserwowano spadku wydajności nawet przy największym stężeniu BSA dodanego w tych warunkach (Rysunek 4). Ograniczony do cyklu efekt zwiększania wydajności PCR przez BSA sugerował, że białko to może z czasem ulegać denaturacji, tracąc w ten sposób swoją skuteczność. Aby sprawdzić tę hipotezę, skonfigurowano PCR, w którym DMSO lub formamid połączono z BSA w początkowym buforze reakcyjnym w najbardziej efektywnych stężeniach określonych powyżej i prowadzono przez 10 cykli przed dodaniem świeżego roztworu BSA (0-10 μg/μl stężenie końcowe). Dodawanie BSA powtarzano przez 30 cykli PCR i analizowano wpływ na wydajność, jak opisano powyżej. Trwały wzrost wydajności można było wykryć, gdy BSA dodawano w co dziesiątym cyklu PCR: na przykład w amplifikacji cheA1 uzyskano prawie 75% wzrost wydajności PCR w stosunku do uzyskanej przy użyciu samego rozpuszczalnika (Rysunek 4). Wyniki zaobserwowane w metodzie, którą nazwaliśmy „BSA PCR step” są zgodne z założeniem, że denaturacja BSA powoduje spadek efektu zwiększania wydajności po piętnastym cyklu PCR. Eksperymenty kontrolne, w których glicerol lub sterylną wodę destylowaną dodawano co dziesiąty cykl, nie zwiększyły wydajności PCR, co wskazuje, że efekty BSA nie są spowodowane zmianą objętości reakcji ani tym, że BSA skutecznie działa jako zagęszczacz molekularny, właściwość przypisywana niektórym efektom glicerolu w PCR . Chociaż dokładne mechanizmy zwiększającego wpływu BSA na wydajność PCR nie są znane, dane uzyskane tutaj i opisane w literaturze wspierają hipotezę, że BSA może stabilizować polimerazę DNA i/lub przeciwdziałać potencjalnemu hamującemu wpływowi wysokich stężeń rozpuszczalników organicznych na aktywność polimerazy DNA. W przypadku amplifikacji cheA4, fragmentu DNA o najwyższej zawartości GC użytego w tym badaniu (73%), uzyskano wzrost wydajności PCR poprzez dodanie BSA, jak również DMSO do PCR, ale wykryto również wiele niespecyficznych produktów amplifikacji (Rysunek 5). Aby rozwiązać ten problem, metoda etapu PCR z BSA została następnie zastosowana w połączeniu z protokołem PCR „Touchdown”, który, jak wcześniej wykazano, poprawia specyficzność PCR. Metoda ta wytworzyła pojedyncze specyficzne pasmo i prawie podwoiła wydajność, która została wytworzona przy użyciu protokołu „Touchdown” i samych rozpuszczalników organicznych (wzrost o 96%) (Rysunek 5). Wyniki te zasugerowały nam również sposób na poprawienie stosunkowo niskiej wydajności metody mutagenezy ukierunkowanej na miejsce w całym plazmidzie, opisanej w QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit (Stratagene), w celu wprowadzenia mutacji w jakimś bogatym w GC szablonie DNA (tutaj gen tlp2, fragment 2,5 kb o 66% GC). Kiedy użyliśmy pUCtlp2 jako szablonu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, wraz ze starterami mutagennymi zaprojektowanymi do wprowadzenia pojedynczej pary zasad w obrębie tlp2 (startery mutagenne zaprojektowane zgodnie ze stroną internetową producenta) i protokołem producenta, fragment 5,324 kb odpowiadający pUCtlp2 był ledwo widoczny (Rysunek 5). Po zakończeniu protokołu mutagenezy zgodnie z instrukcjami producenta, nie uzyskano żadnej kolonii lub uzyskano niewielką liczbę kolonii (średnio mniej niż 5), które zawierały plazmidy rodzicielskie pozbawione pożądanej mutacji. Ten typ wyników, charakteryzujący się niską wydajnością mutagenezy, został wcześniej uznany za powszechną pułapkę tej metody. Jednakże, gdy BSA został dodany do buforu producenta na każdym z pięciu etapów, wykryto wyraźny produkt amplifikacji (Rysunek 5). Po zakończeniu protokołu producenta, uzyskano ponad 100 kolonii z 2/3 niosącymi pożądaną mutację (określoną przez sekwencjonowanie). Zastosowaliśmy również etap BSA PCR w protokole overlap extension do skonstruowania chimerycznego białka fuzyjnego pomiędzy genem A. brasilense (ATM, 650 bp) i białkiem cyjan fluorescencyjnym (CFP) (720 bp). W metodzie overlap extension PCR, 2 zestawy par starterów są najpierw używane do amplifikacji dwóch fragmentów DNA, które mają być połączone, a których sekwencje pokrywają się ze sobą. Trzecia amplifikacja wykorzystuje produkty amplifikacji z pierwszych reakcji jako szablony, wraz z najbardziej zewnętrznymi primerami reverse i forward, w celu wygenerowania chimerycznych konstrukcji. Amplifikacja dwóch początkowych fragmentów DNA, ATM i CFP była bardzo wydajna przy użyciu standardowych protokołów PCR i nie można było uzyskać znaczącego wzrostu przy użyciu protokołu BSA PCR Step (dane nie pokazane). Jednakże, drugi, nakładający się etap PCR, wytworzył liczne niespecyficzne produkty amplifikacji i niewiele, jeśli w ogóle, pożądanego amplikonu chimerycznego (ATM-CFP; Tabela 1) (rysunek 5). Nieswoiste produkty amplifikacji zniknęły, gdy zastosowano metodę PCR „Touchdown”, ale specyficzny, pożądany amplikon chimeryczny pozostał w bardzo małej ilości, jak wykryto przez bardzo słabe pasmo 1,370 bp ATM-CFP (rysunek 5). Zastosowanie metody BSA PCR Step wraz z protokołem „Touchdown” zaowocowało 72% wzrostem wydajności amplikonu chimerycznego ATM-CFP (Figura 5). Późniejsze klonowanie i sekwencjonowanie potwierdziło, że uzyskano prawidłowy konstrukt chimeryczny.
Wpływ DMSO i formamidu na amplifikację PCR szablonów bogatych w GC. Typowe przykłady wpływu dodatku DMSO i formamidu w różnych stężeniach na amplifikację metodą PCR 2-3 kb szablonów DNA bogatych w GC. A) Wpływ DMSO na amplifikację PCR dla che1P (góra) i tlp2 (dół) obserwowany za pomocą elektroforezy żelowej całkowitych produktów PCR. Żele wybarwiono bromkiem etydyny i sfotografowano. B) Wpływ formamidu na amplifikację PCR che1P (góra) i tlp2 (dół) w porównywalnych eksperymentach.
Wpływ BSA jako koaddytywu z rozpuszczalnikami organicznymi na zwiększenie wydajności PCR. Typowe przykłady wpływu BSA jako koaddytywu z DMSO i formamidem, w różnych stężeniach, na amplifikację PCR bogatych w GC szablonów DNA. A) Wpływ DMSO na PCR che1P (po lewej) oraz łączny wpływ DMSO z 6 μg/μl BSA (po prawej) obserwowany metodą elektroforezy żelowej całkowitego produktu PCR. B) Wpływ formamidu na amplifikację PCR che1P (po lewej) i łączny efekt formamidu z 6 μg/μl BSA (po prawej) w porównywalnych eksperymentach.
Efekt dodatku BSA jako ko-enhancera z rozpuszczalnikami organicznymi na wydajność PCR. Wzrost wydajności PCR jest wyrażony w stosunku do wydajności PCR uzyskanej bez żadnego dodatku. Na wszystkich panelach zastosowano następującą legendę: linia czerwona, tylko DMSO (7,5%); linia zielona, tylko formamid (2,5%); linia fioletowa, DMSO (7,5%) i BSA (6 μg/μl); linia jasnoniebieska, formamid (2,5%) i BSA (6 μg/μl). A) amplifikacja PCR che1P (392 bp); B) amplifikacja PCR tlp5P (798 bp); C) amplifikacja PCR tlp2 (2,638 bp); D) amplifikacja PCR cheA1 (3,389 bp); E) amplifikacja PCR cheOP1 (7,103 bp).
Efekt BSA jako koaddytywu z rozpuszczalnikami organicznymi, gdy jest dodawany na pośrednich etapach PCR. A) Wpływ dodatku BSA na wydajność PCR, gdy dodawany co dziesięć cykli dla fragmentów DNA o szerokim zakresie wielkości (392 bp do 7,103 bp); B) Reprezentatywny przykład wpływu dodatku BSA na amplifikację PCR cheA1 (3,389 bp) w obecności DMSO, jak wykryto poprzez analizę fragmentów DNA amplifikowanych metodą elektroforezy żelowej.
Efekt BSA jako koaddytywu z rozpuszczalnikami organicznymi w różnych zastosowaniach PCR. A) Reprezentatywny przykład wpływu dodatku BSA (BSA Step) jako ko-addytywu efektu DMSO na amplifikację PCR cheA4 w protokole PCR „Touchdown”, jak wykryto za pomocą elektroforezy żelowej. B) Reprezentatywny przykład wpływu protokołu BSA Step stosowanego w mutagenezie ukierunkowanej przez miejsce (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) na amplifikację PCR pUCtlp2, wykrywany przez elektroforezę w żelu. C) Reprezentatywny przykład efektu protokołu BSA Step stosowanego w aplikacji PCR z przedłużaniem nakładania, łączącego ATM z CFP w celu uzyskania ATM-CFP, wykrywany przez elektroforezę w żelu.
.