Buckwheat Flour

Genome Resources

Przeprowadzono znaczną ilość badań nad funkcjonalnościami i właściwościami białek gryki, flawonoidów, flawonów, fitosteroli, białek wiążących tiaminę i innych rzadkich związków (Li i Zhang, 2001; Tomotake et al., 2002; Kreft et al., 2006; Zielinski et al., 2009). Jednakże dostępność zasobów genomowych, takich jak dobra mapa pokrewieństwa, różne klasy markerów molekularnych, biblioteki EST, biblioteki big-insert DNA, itp. jest ograniczona. Istnieją fragmentaryczne doniesienia na temat zrozumienia relacji między gatunkami przy użyciu markerów molekularnych, takich jak łańcuchowa reakcja polimerów (PCR) oparta na DNA fingerprinting, która została wykorzystana do wykazania relacji między gatunkami w Fagopyrum indyjskim. Spośród 75 losowych 10-merowych starterów testowanych na 14 dostępach i dwóch podgatunkach Fagopyrum, tylko 19 wygenerowało powtarzalne pasma (Sharma i Jana, 2002a). W sumie zaobserwowano 364 pasma, średnio 19,15 pasm na starter, z których 99,45% było polimorficznych, co pomogło wyjaśnić pokrewieństwo międzygatunkowe w Fagopyrum (Sharma i Jana, 2002b). Scharakteryzowaliśmy również 51 akcesji F. esculentum (29), F. tataricum (20) i F. cymosum (2) przy użyciu losowo amplifikowanego polimorficznego DNA (RAPD) (Sethilkumarn i in., 2007). Dane dotyczące populacji poszczególnych gatunków wykazały, że F. tataricum był stosunkowo bardziej polimorficzny niż F. esculentum. Oczekiwana heterozygotyczność była większa w przypadku F. esculentum z powodu jego outcrossingowego charakteru. Wartość szacunkowego wskaźnika utrwalenia (FST) wskazywała na niskie zróżnicowanie między populacjami danego gatunku w ujęciu strefowym. Struktura gatunkowa populacji wskazywała na większe zróżnicowanie między gatunkami niż między strefami. Zróżnicowanie między gatunkami jest silne, na co wskazuje obliczona wartość FST, która mieści się powyżej górnej granicy 95%. Analiza RAPD wykazała również, że F. cymosum był bardziej zbliżony do F. esculentum niż F. tataricum. Opracowano mapę genetyczną dla F. esculentum i F. homotropicum na podstawie odpowiednio 223 i 211 markerów AFLP (Yasui i in., 2004). Mapa F. homotropicum ma osiem grup powiązań z 211 markerami AFLP obejmującymi 548,9 cM. Markery mikrosatelitarne zostały opracowane dla gryki zwyczajnej poprzez sekwencjonowanie 2785 klonów z bibliotek. Wykazano, że 1483 klony zawierały mikrosatelity wzbogacone o powtórzenia (CT)n i (GT)n. Zaprojektowano pary starterów dla 237 loci mikrosatelitarnych, z czego 180 par starterów uległo amplifikacji. Spośród nich 44 pary starterów oceniono pod kątem ich zdolności do wykrywania różnic w populacjach gryki zwyczajnej i wykorzystano w siedmiu spokrewnionych gatunkach Fagopyrum, w tym F. tataricum (Konishi i in., 2006). Jedna biblioteka sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC) została skonstruowana z dzikiego gatunku gryki, F. homotropicum (Nagano i in., 2001). Możliwość zastosowania 17 starterów EST opracowanych dla gryki zwyczajnej testowano na innych dzikich i uprawnych gatunkach Fagopyrum (Joshi i in., 2006). Produkty amplifikacji różniły się intensywnością pasm. Brak dobrze opracowanej mapy pokrewieństwa i dostępność ograniczonej liczby markerów molekularnych w gryce skłoniły nas do poszukiwania alternatywnych rozwiązań in silico, umożliwiających szybką identyfikację dodatkowych markerów molekularnych. Wykorzystaliśmy ESTs dostępne u innych gatunków roślin należących do taksonomicznie wspólnego rzędu gatunków Fagopyrum. Gryka należy do rodziny Polygonaceae i rzędu Caryophyllales, dlatego do identyfikacji markerów molekularnych takich jak SSR wybraliśmy te gatunki roślin, które należą do tego samego rzędu. Wszystkie EST dostępne w danym gatunku roślin (Tabela 9.5) zostały pobrane z bazy danych TIGR (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/tgipage.html).

SSR zostały zidentyfikowane w ESTs przy użyciu PGG Bioinformatics at (http://hornbill.cspp.latrobe.edu.au/cgi-binpub/autosnip/index_autosnip.pl) i zaprojektowano startery do ich amplifikacji. Zaprojektowano i zsyntetyzowano pary starterów dla 141 SSR na podstawie długości powtórzeń, z których 13 SSR uległo amplifikacji na genotypach F. tataricum, co wskazuje na słabą przenośność SSR. Pięćdziesiąt cztery SSR, które zostały zidentyfikowane przez Konishi et al. (2006) w F. esculentum, były również testowane na wybranych dostępach F. tataricum, ale nie stwierdzono polimorfizmu na wybranych dostępach.

Próbowaliśmy również zbadać genomikę porównawczą genów zaangażowanych w biosyntezę rutyny. Szlak biosyntezy rutyny został wyjaśniony w różnych gatunkach roślin. Dziewięć znanych genów zaangażowanych w szlak biosyntezy rutyny to: amoniakalna laza fenyloalaninowa, cynamonian-4-hydroksylaza (C4H), ligaza 4-kumarylo-CoA (4CL), syntaza chalkonowa (CHS), izomeraza chalkonowa, syntaza flawonolowa, flawanon-3-hydroksylaza (F3H), flawanon-3′-hydroksylaza oraz transferaza glukozylo/rhamnosylowa. Spośród nich, dwa geny, CHS i transferaza glukozylowa, zostały zidentyfikowane odpowiednio u F. esculentum i F. tataricum (Hrazdina i in., 1986; Suzuki i in., 2005b). Wykorzystaliśmy genomikę porównawczą do zidentyfikowania i sklonowania pozostałych genów biosyntezy rutyny w gryce tatarskiej. Ponieważ większość genów występuje w wielu kopiach w genomach roślin, użyliśmy informacji o genomie Arabidopsis, aby zidentyfikować najbardziej znaczącą kopię każdego genu.

Sekwencje nukleotydowe i białkowe genów zaangażowanych w biosyntezę rutyny zostały pobrane z różnych gatunków roślin, a wielokrotne wyrównania sekwencji zostały wykonane w celu określenia stopnia podobieństwa sekwencji. Pary primerów zostały zaprojektowane z konserwowanych regionów sekwencji genów pobranych z roślin dwuliściennych, a następnie przetestowane na gatunkach Fagopyrum (gryka zwyczajna, gryka tatarska i gryka tatarska). Wszystkie geny uległy amplifikacji w Fagopyrum. W przypadku CHS, 4CL i glukozylo/rahamnozylo transferaz uzyskano amplifikację jednopasmową, natomiast w przypadku F3H i C4H amplifikowano wiele kopii genów. Genotypy F. tataricum wykazujące kontrastowe zróżnicowanie pod względem zawartości rutyny są wykorzystywane do identyfikacji wariantów sekwencji DNA w genach zaangażowanych w biosyntezę rutyny. Identyfikacja polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genotypach o wysokiej i niskiej zawartości rutyny będzie miała duże znaczenie w hodowli molekularnej gryki na wysoką zawartość rutyny. Genotypy o wysokiej zawartości rutyny są również wykorzystywane do identyfikacji genów regulatorowych kontrolujących biosyntezę rutyny poprzez analizę różnicową (differential display). Konstruujemy również bibliotekę BAC z genotypu o wysokiej zawartości rutyny, łatwego do obłuszczenia, w celu klonowania użytecznych genów. Biblioteka BAC będzie bardzo przydatna w genomice F. tataricum.

Gupta i wsp. (2012) badali profilowanie różnicowe transkryptów poprzez cDNA-AFLP w etapach dojrzewania nasion (od kwiatostanu do dojrzewania nasion) z 32 kombinacjami starterów generujących łącznie 509 fragmentów transkryptów (TDFs). Sto sześćdziesiąt siedem TDF zostało wyekstrahowanych, sklonowanych i zsekwencjonowanych z F. tataricum i F. esculentum. TDFs reprezentowały geny kontrolujące różne procesy biologiczne, takie jak podstawowy i wtórny metabolizm (33%), regulacja (18%), transdukcja sygnału (14%), transport (13%), organizacja komórkowa (10%) oraz fotosynteza i energia (4%). Większość TDFs, z wyjątkiem tych należących do metabolizmu komórkowego, wykazywała relatywnie wyższą obfitość transkryptów u F. tataricum niż u F. esculentum. Stwierdzono, że oprócz genów strukturalnych, inne klasy genów, takie jak regulatory, modyfikatory i transportery są również ważne w biosyntezie i akumulacji zawartości flawonoidów w roślinach. Technologia cDNA-AFLP została z powodzeniem wykorzystana do wychwycenia genów, które przyczyniają się do różnic w zawartości rutyny w fazach dojrzewania nasion gatunków Fagopyrum. Zwiększona obfitość transkryptów TDF podczas przejścia od kwiatów do dojrzewania nasion sugeruje ich udział nie tylko w wyższej zawartości rutyny u F. tataricum w porównaniu z F. esculentum, ale także w wyższości żywieniowej tego pierwszego.

Testowaliśmy także specyficzne dla genów markery STS wobec 91 dostępów gryki w celu wyjaśnienia różnorodności allelicznej w tych loci. Spośród 27 badanych loci STS, tylko 18 dało amplifikację możliwą do oznaczenia. Pozostałe dziewięć starterów albo amplifikowało allele zerowe (mniej prawdopodobne), albo wymagało selekcji innego regionu genu w celu uzyskania wykrywalnego produktu PCR. BW16 amplifikował tylko jeden allel, podczas gdy BW10 aż pięć alleli. Wśród pozostałych osiem markerów wzmacniało dwa allele; sześć markerów wzmacniało trzy allele; a dwa markery wzmacniały cztery allele. Średnio te startery STS amplifikowały 2,7 pasma na locus. Cztery z markerów STS, BW10 (Fe2SA1, białko alergenowe o masie 8 kD), BW12 (główne alergenne białko magazynowe, FAGAG1), BW22 (białko odrzucane podczas rozwoju nasion) i BW27 (inhibitor proteazy, BTIw1), wykazały znaczny polimorfizm (PIC > 0,5) wśród 91 odmian gryki. Jednakże, ogólnie markery wykazały umiarkowane szacunki zawartości informacji polimorficznej (0,268), obserwowanej heterozygotyczności (0,259) i oczekiwanej heterozygotyczności (0,318). Jednym z możliwych powodów umiarkowanych szacunków polimorfizmu może być fakt, że loci STS były zlokalizowane w genach odpowiedzialnych za główne funkcje i dlatego sekwencje mogły być stosunkowo konserwowane.

Asocjacja fenotypów markerów wykazała, że spośród 24 cech morfologicznych, 18 cech nie wykazywało absolutnie żadnego powiązania z profilami markerów. Masa testowa, dni do osiągnięcia dojrzałości, długość liści, liczba głównych gałęzi, wysokość roślin i kształt nasion wykazywały różny stopień asocjacji marker-trasa. Geny gospodarza markera STS wykazujące asocjację to BW10 (białko alergenowe 8 kD), BW18 (proteinaza asparaginowa 9), BW13 (białko podobne do leguminy), BW17 (syntaza chalkonu), BW22 (białko zmniejszające się podczas rozwoju nasion), BW09 (globulina 13S), BW25 (cysperoksiredoksyna) i BW24 (syntaza fagopirytolu 1). Wyniki te zachęcają do badania większej liczby linii zarodkowych i zastosowania markerów zidentyfikowanych jako przypuszczalnie związane z określonymi cechami w populacjach screen-mappingowych.

Zastosowanie gryki

Gryka jest rośliną uprawną, która przynosi ogromne korzyści agronomiczne i żywieniowe. Mąka gryczana ma wiele zastosowań. Jest używana w mieszankach do naleśników, jak również w różnych chlebach. Jest często mieszana z mąką pszenną w celu wykorzystania w chlebie, makaronach i niektórych płatkach śniadaniowych (Robinson, 1980). Mąka gryczana, popularnie znana jako kuttu ka atta, w Indiach jest spożywana w dni postu, będąc jednym z dozwolonych pokarmów na takie okazje. Czasami mąka ta jest robiona na pastę, z warzywami i solą, i robiona w małe kulki, smażona i podawana na gorąco, lokalnie nazywana pakoras; inne podobne solone przetwory nazywane są chillare i jalebi w Indiach lub sil i fulaura w Nepalu, lub, gdy są przygotowane z cukrem, puwa we wschodnich i halwa w zachodnich Himalajach. Gryka jest również tłuczona i gotowana jak ryż i spożywana jako substytut ryżu. Gryka stanowi uzupełnienie mąk zbożowych i może być wykorzystywana do poprawy ich jakości odżywczej, ponieważ jest bogata w niezbędne aminokwasy. Badania wykazały, że do 60% mąki gryczanej zmieszanej z mąką pszenną można uzyskać akceptowalny chleb (Pomeranz, 1983). Kasza gryczana jest podawana jako część racji żywnościowych żołnierzy i gotowana z masłem, łojem lub olejem z nasion konopi w Rosji.

Ostatnio gryka została również wprowadzona jako żywność nutraceutyczna. Nutraceutyk jest zdefiniowany jako każda substancja, która jest żywnością lub częścią żywności i zapewnia korzyści medyczne lub zdrowotne, w tym zapobieganie i leczenie chorób (DeFelice, 1994). Gryka zawiera witaminę P, która zawiera flawonoid rutynę. Rutyna jest znana ze swojej skuteczności w obniżaniu poziomu cholesterolu we krwi. Ponadto, gryka jest skutecznym środkiem zapobiegawczym przeciwko wysokiemu ciśnieniu krwi. Rutyna jest znana z tego, że utrzymuje naczynia włosowate i tętnice mocne i elastyczne. Skuteczność rutyny w gryce jest wzmocniona przez dodatek witaminy C. Wykazano, że regularne spożywanie 30 g gryki obniża ciśnienie krwi niezależnie od innych czynników, takich jak wiek i waga. W badaniu przeprowadzonym we współpracy z Johns Hopkins Medical Institute, Jiang i wsp. (1995) stwierdzili, że osoby, które spożywały najwięcej gryki, miały najniższe ciśnienie krwi. Kwitnące pola gryki mogą służyć jako cenne źródło nektaru dla pszczół. Miód wyprodukowany z gryki jest zazwyczaj ciemny i ma silniejszy smak niż miód wyprodukowany z koniczyny i jest preferowany przez niektórych konsumentów.

.