Non-organoid Approaches
Do tej pory linie komórkowe nabłonka jelitowego były głównymi systemami modelowymi in vitro do oceny procesów transportu jelitowego, podczas gdy enteroendokrynne linie komórkowe są powszechnymi modelami do badania wydzielania różnych hormonów jelitowych. Uznanym modelem dla enterocytów jelita cienkiego jest linia komórkowa CaCo-2 (lub podklon CaCo-2 TC7), pochodząca z gruczolakoraka jelita grubego. Ta linia komórkowa jest powszechnie hodowana na płytkach transwaginalnych do 3 lub 4 tygodni po konfluencji do badań nad jelitowym transportem składników odżywczych, leków lub innych związków przy użyciu substratów znakowanych radioaktywnie lub fluorescencyjnie (Farrell i in., 2013; Ganapathy i in., 1995; Wang i Li, 2017). Komórki HT-29 (i podklony) są ludzką linią komórkową raka jelita grubego dobrze przyjętą do badań nad transporterami jelitowymi, w szczególności transporterami cukru (Delezay i in., 1995; Liu i in., 2016). W celu zbadania roli transporterów w jelitowym wyczuwaniu składników odżywczych potrzebne są jednak inne linie komórkowe. Najbardziej znane enteroendokrynne linie komórkowe wykorzystywane do badań nad sekrecją hormonów jelitowych to: murine GLUTag cell line (Emery i in., 2015), murine STC-1 cell line (Jiang i in., 2016) oraz human NCI-H716 cell line (Pais i in., 2014). Żadna z nich nie odzwierciedla jednak złożonej biologii komórek enteroendokrynnych in vivo (Kuhre i wsp., 2016). Komórki enteroendokrynne są rozmieszczone w całym jelicie cienkim i grubym, a ich wzorce ekspresji różnych hormonów jelitowych bardzo się różnią, w zależności od ich lokalizacji w obrębie przewodu pokarmowego (Habib i wsp., 2012). Na przykład, liczba komórek wydzielających GLP-1 (często określanych jako komórki L) wzrasta stopniowo od proksymalnej do dystalnej części jelita, podczas gdy liczba komórek wydzielających GIP (określanych jako komórki K) maleje. Linie komórkowe enteroendokrynne, pochodzące z nowotworów, stanowią zatem bardzo proste i sztuczne systemy modelowe do badań nad wyczuwaniem składników odżywczych, wydzielaniem hormonów jelitowych oraz mechanizmami molekularnymi i regulacyjnymi. Zaletą linii komórkowych ssaków jest to, że są one dobrze poznane przez wiele laboratoriów na całym świecie. Dostępna jest duża ilość danych naukowych, jak również ustalone protokoły eksperymentalne. Ponadto, są one łatwe w obsłudze, a ich hodowla jest tania. Wszystkie te linie komórkowe są jednak bardzo prostymi i sztucznymi systemami modelowymi. Pochodzą one głównie z nowotworów i reprezentują tylko jeden typ komórek, nie odzwierciedlając złożoności błony śluzowej jelita, która składa się z wielu wyspecjalizowanych typów komórek. Ponadto są one zwykle hodowane w dwóch wymiarach, co nie odzwierciedla trójwymiarowej architektury rodzimego jelita.
W szczególności, do badań nad wyczuwaniem składników odżywczych i wydzielaniem hormonów jelitowych, pierwotne hodowle komórek jelitowych są znacznie lepszym podejściem i zostały ustanowione jako wiarygodny model w ostatnich latach (Reimann i in., 2008). Pierwotne kultury wyhodowane z izolowanych krypt jelitowych mają tę zaletę, że mogą być generowane z różnych segmentów jelita (Parker i in., 2012), a także od myszy (zwierzęta typu dzikiego lub knockout) (Diakogiannaki i in., 2013) lub ludzi (Habib i in., 2013). W ich skład wchodzą enterocyty absorpcyjne, jak również różne podtypy komórek enteroendokrynnych, występujące w rodzimym jelicie. Kultury te zawierają jednak słabo zróżnicowane enterocyty, dlatego nie są odpowiednie do wykrywania jelitowych transporterów i receptorów na poziomie białkowym lub funkcjonalnym. Są one krótkoterminowym systemem hodowlanym, nieodpowiednim do długoterminowych eksperymentów i nie mogą być poddawane pasażowaniu, co zwiększa liczbę zwierząt laboratoryjnych potrzebnych do przygotowania hodowli. Podobnie jest w przypadku izolowanych komórek nabłonka jelitowego (Grossmann i in., 1998), które obejmują wszystkie typy komórek błony śluzowej, ale wykazują bardzo ograniczoną żywotność w warunkach in vitro i nie reprezentują nienaruszonego nabłonka.
Krótkoterminowa stabilność jest również ograniczeniem eksplantatów tkankowych, takich jak pierścienie jelitowe z wytrzewieniem (Roder i in., 2014), lub woreczki jelitowe z jelita myszy lub szczura (Praslickova i in., 2012; Surampalli i in., 2016), które są często wykorzystywane do badań nad transportem. Wyprostowane pierścienie jelitowe mogą być albo inkubowane ze znakowanymi substratami in vitro, albo mogą być przygotowane po doustnym podaniu np. znakowanych radioaktywnie substratów transporterowych u gryzoni (Roder i in., 2014). Wyprostowane worki jelitowe mogą być nawet wykorzystywane do badań strumienia, ponieważ przedziały luminalny i basolateralny mogą być ukierunkowane oddzielnie. Jednak przygotowanie i obsługa nie są trywialne i wymagają pewnego doświadczenia. Zaletą eksplantatów tkankowych jest to, że mogą być one przygotowane z różnych segmentów jelita, a ich specyficzne dla danego regionu cechy in vivo są zachowane w warunkach in vitro. Eksplantat jelitowy zachowuje swoją natywną architekturę, a błona śluzowa jest połączona z otaczającymi ją tkankami, takimi jak błona podśluzowa czy mięśnie, a także neurony, limfa, naczynia krwionośne. W zależności od zagadnienia naukowego, może to być zaletą lub wadą. Jelitowe wyczuwanie składników odżywczych i późniejsze wydzielanie hormonów jelitowych jest czasami badane w perfundowanym jelicie gryzoni (Kuhre i in., 2015). Zwierzę jest znieczulane, a światło jelita jest perfundowane z przypuszczalnymi stymulantami ex vivo. Płyn podstawno-boczny jest zbierany, a zawartość hormonów jelitowych jest analizowana. Technika ta nie jest łatwa technicznie, a przeszkody etyczne ograniczają szerokie zastosowanie tej metody w badaniach nad uwalnianiem hormonów jelitowych indukowanym składnikami odżywczymi.
Wiarygodnym i dobrze ugruntowanym modelem wykorzystywanym do badań nad charakterystyką funkcjonalną i regulacją transporterów jelitowych jest heterologiczna ekspresja w oocytach Xenopus laevis (Hirsch i in., 1996). Po wstrzyknięciu mRNA, interesujące nas białko ulega ekspresji w oocycie, a kinetyka transportu może być badana przy użyciu substratów znakowanych radioaktywnie lub metod elektrofizjologicznych w przypadku transporterów elektrogennych (Schulze i in., 2014; Stelzl i in., 2016). Technika ta jest doskonałym narzędziem do badania charakterystyki funkcjonalnej jednego konkretnego transportera, mimo że białko docelowe znajduje się w sztucznym środowisku i nie są obecne żadne czynniki regulacyjne, tak jak miałoby to miejsce w komórce ssaków. Ponadto, dostępność nienaruszonych oocytów i skomplikowana obsługa, w tym wstrzykiwanie oocytów, są krytycznymi kwestiami, które należy rozważyć przy stosowaniu tej techniki. Znacznie łatwiejszymi systemami ekspresji heterologicznej są drożdże i E. coli. Umożliwiają one generowanie rekombinowanych mutantów, które po wytworzeniu mogą być hodowane lub fermentowane na większą skalę, dostarczając dużych ilości białka. Mikroorganizmy te, choć tanie i łatwe w obsłudze, są bardzo uproszczonymi systemami modelowymi do badania białek ssaków, a w szczególności dużych białek błonowych. Problemy, które często się pojawiają, to niewłaściwe składanie białka lub nieudane wprowadzanie go do błony. Dlatego systemy te są raczej bardziej przydatne do strukturalnej charakterystyki oczyszczonych białek lub domen białkowych (Beale i in., 2015) niż do szczegółowych badań nad funkcją i regulacją transporterów ssaków.
Nowatorskie i obiecujące podejścia, które powstały w bardzo niedawnej przeszłości, to trójwymiarowe modele hodowli komórkowych ssaków. Jelitowe linie komórkowe, takie jak CaCo-2 lub HT-29 są hodowane na rusztowaniach, tworząc architekturę bardziej przypominającą jelito, co prowadzi do lepszego różnicowania (Chen i in., 2015). Inne trójwymiarowe modele są hodowane bezpośrednio z ludzkich komórek nabłonka jelita cienkiego i miofibroblastów na powlekanych membranach mikroporowatych (Maschmeyer i in., 2015a; Maschmeyer i in., 2015b) i nie mogą być namnażane in vitro. Modele te mogą być potencjalnie stworzone do badań nad transportem składników odżywczych lub leków, a hodowle wyhodowane z ludzkich komórek nabłonka jelitowego obejmują nawet różne typy komórek śluzówki, ale nie komórki enteroendokrynne. Podobnie jest w przypadku trójwymiarowych tkanek drukowanych metodą bioprintingu, kolejnej technologii, która pojawiła się bardzo niedawno i zyskała ogromną uwagę. Podejście to ma większą wartość dla medycyny regeneracyjnej i transplantacji niż dla badań eksperymentalnych (Murphy i Atala, 2014). Bioprinting różnych tkanek, w tym serca, skóry i kości, został pomyślnie ustanowiony, ale bioprintowane tkanki jelitowe są jak dotąd rzadkością i wymagają dalszego doskonalenia (Wengerter i in., 2016).