CD11c+ monocyte/macrophages promote chronic Helicobacter hepaticus-induced intestinal inflammation through the production of IL-23

H. hepaticus-driven inflammation alters the intestinal mononuclear phagocyte compartment

Bakteria Gram-ujemna Helicobacter hepaticus (Hh) jest nieinwazyjnym organizmem powszechnie występującym w warstwie śluzowej dolnego odcinka jelita u myszy. U zwierząt typu dzikiego zakażonych tą bakterią nie dochodzi do rozwoju immunopatologii jelitowej i służą one jako nosiciele zakażenia.21 Jednak myszy z genetycznymi niedoborami w szlaku IL-10/IL-10R są podatne na eksperymentalne zakażenie Hh i rozwijają ciężkie zapalenie okrężnicy i kątnicy (typhlocolitis) związane z hiperplazją nabłonka.22, 23 Podobnie, zakażenie Hh myszy typu dzikiego z jednoczesnym podawaniem przeciwciał monoklonalnych anty-IL-10R (mAbs) wyzwala zależne od IL-23 zapalenie jelit wraz z silną odpowiedzią spolaryzowanych efektorowych komórek T helpera typu 1/typu 17 (Th1/Th17)23. Myszy zakażone Hh i leczone przeciwciałami anty-IL-10R, ale nie niezakażone lub kontrolne leczone pojedynczo, rozwijają histologiczne cechy zapalenia jelita grubego w ciągu 2-3 tygodni po zakażeniu (Figura 1a). Myszy poddane działaniu Hh i anty-IL-10R wykazują ponadto wyraźny naciek leukocytów w obrębie blaszki właściwej (Figura 1b), w tym dominujące populacje neutrofili i monocytów MHCII+ (Figura 1c i Suplementacyjna Figura S1a online). W jelicie grubym bez zapalenia monocyty dostające się z krwi do blaszki właściwej preferencyjnie dają początek makrofagom tkankowym11 (zdefiniowanym jako CD11b+ CX3CR1hi Ly6Clo, zielony podzbiór), wyrażającym wysoki poziom CD64, MHCII, F4/80 i CD11c (Figura 1d i Dodatkowa Figura S1b). Jednakże proces ten jest dramatycznie zmieniony podczas zapalenia i zaobserwowaliśmy wyraźną akumulację monocytów MHCII+ (zdefiniowanych jako komórki CD11b+ CX3CR1int Ly6Chi, czerwony podzbiór) w obrębie propria lamina okrężnicy. Komórki te charakteryzują się ekspresją CD64 i MHCII oraz pośrednimi poziomami F4/80, CD24 i CD11c (Figura 1c-e i Dodatkowa Figura S1a). W stanie ustalonym monocyty i makrofagi MHCII+ wyrażają receptor mannozy (CD206), marker związany z przeciwzapalną funkcją makrofagów.24 Jednak ekspresja CD206 była niższa w monocytach i makrofagach MHCII+ podczas zapalenia jelita grubego (Figura 1f), co sugeruje, że nie tylko funkcje monocytów, ale także makrofagów zostały zmodyfikowane podczas zapalenia. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że podczas zapalenia monocyty MHCII+ wyrażały większe ilości białka czynnika martwicy nowotworów-α i IL-6 oraz mRNA Nos2 (indukowalna syntaza tlenku azotu), a IL-6 była również zwiększona w makrofagach (Dodatkowa Figura S1c). Produkcja IL-10 zarówno przez monocyty MHCII+, jak i makrofagi była również zwiększona podczas zapalenia (Supplementary Figure S1c), najprawdopodobniej odzwierciedlając napędzaną zapaleniem ścieżkę ujemnego sprzężenia zwrotnego.

Poza różnicowaniem się w makrofagi, wykazano również, że monocyty MHCII+ różnicują się w heterogeniczny podzbiór Ly6Clo CX3CR1int związany zarówno z makrofagami, jak i klasycznymi DC.11. Wśród tego heterogennego przedziału, CD11b+ DCs (zdefiniowane jako komórki CD11c+ CD103- CD11b+ CX3CR1int, szary podzbiór) mogą być łatwo odróżnione od makrofagów w warunkach homeostatycznych. CD11b+ DCs wykazują ekspresję MHCII, CD24 i CD11c, ale nie wykazują ekspresji CD64 i F4/80, markerów powszechnie kojarzonych z makrofagami (Figura 1d i Dodatkowa Figura S1b). Jednak rozróżnienie między makrofagami a CD11b+ DCs zostało zatarte podczas zapalenia przez pojawienie się populacji wykazującej ekspresję CD64 (Figura 1d,e) i obecnie nie jest jasne, jak te komórki ontogenetycznie i funkcjonalnie odnoszą się do makrofagów w stanie stacjonarnym lub CD11b+ DCs.

Podczas zapalenia jelita grubego wyraźna akumulacja monocytów MHCII+ korelowała ze zmniejszoną częstością makrofagów, CD11b+ DCs i CD103+ DCs (zdefiniowanych jako komórki CD11c+ CD103+ CX3CR1-, pomarańczowa podgrupa) wśród komórek CD45+ lamina propria (Figura 1c,d). Jednakże liczby bezwzględne wskazywały na niewielki wzrost CD11b+ DCs i CD103+ CD11b+ DCs. W przeciwieństwie do tego, liczby makrofagów pozostały niezmienione, a CD103+ CD11b- DCs były nieznacznie zmniejszone (Supplementary Figure S1a).

W sumie, infekcja Hh w obecności blokady IL-10R wyzwala zapalenie jelit związane z dramatycznymi zmianami w przedziale mieloidalnym. Obserwowaliśmy dominującą akumulację granulocytów i monocytów MHCII+ w obrębie lamina propria okrężnicy. Ponadto monocyty MHCII+ i makrofagi uzyskały bardziej prozapalny profil.

Fagocyty jednojądroweCD11c+ napędzają zapalenie jelita grubego poprzez produkcję IL-23

Ponieważ IL-23 została zidentyfikowana jako główny czynnik napędzający zapalenie jelita grubego w tym modelu,23 zbadaliśmy następnie znaczenie funkcjonalne produkcji IL-23 przez fagocyty jednojądrowe w rozwoju zapalenia jelita grubego w modelu Hh+anti-IL-10R. Dlatego skrzyżowaliśmy myszy wyrażające białko zielonej fluorescencji (GFP) i rekombinazę Cre pod kontrolą promotora CD11c (kodowanego przez Itgax)25, 26 z myszami posiadającymi dwa miejsca loxP flankujące cztery eksony genu Il23a27 w celu wygenerowania myszy Cd11c-cre.Il23afl/fl (CD11cIL-23-).

Ponieważ myszy CD11cIL-23- wyrażają GFP pod kontrolą promotora CD11c i dlatego nie można ich skrzyżować z myszami reportera CX3CR1-GFP, oparliśmy się na alternatywnej strategii bramkowania, aby ocenić przedział mieloidalny u tych myszy (Supplementary Figure S2). W stanie ustalonym myszy CD11cIL-23- miały podobną liczbę leukocytów w jelicie grubym, jak ich odpowiedniki z niedoborem IL-23 (CD11cIL-23+) (Dodatkowa Figura S3a) i nie zaobserwowano znaczących zmian w częstości komórek mieloidalnych lub T (Dodatkowa Figura S3b). Jednakże, ponieważ IL-23 jest wymagana do utrzymania zróżnicowanych komórek Th17,28 myszy CD11cIL-23- wykazywały silnie zmniejszone poziomy IL-17+ i IL-17+ IFNγ+ CD4+ komórek T w okrężnicy (Dodatkowa Figura S3c).

Po zakażeniu Hh i leczeniu anty-IL-10R, myszy CD11cIL-23- wykazywały uderzającą redukcję zapalenia jelita grubego w porównaniu z myszami CD11cIL-23+, ze zmniejszoną hiperplazją krypt nabłonkowych i mniejszą infiltracją leukocytów w całej okrężnicy i kątnicy (Figura 2a,b). Myszy CD11cIL-23- nie wykazywały również rozwoju splenomegalii (Figura 2c), wskazując, że były one również chronione przed ogólnoustrojowymi objawami choroby. Zmniejszona patologia obserwowana u myszy CD11cIL-23- nie była konsekwencją zróżnicowanego obciążenia bakteryjnego, ponieważ poziomy kolonizacji Hh były podobne w grupach CD11cIL-23- i CD11cIL-23+ (Figura 2d). Zgodnie ze zmniejszonymi zmianami patologicznymi, zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne cytokiny efektorowe były silnie zmniejszone w okrężnicy myszy CD11cIL-23- po blokadzie Hh i IL-10R (Figura 2e), podobnie jak ilość samej IL-23 (Figura 2f).

Zgodnie z ich zmniejszoną infiltracją leukocytów, myszy CD11cIL-23- wykazywały zmniejszoną częstotliwość i liczbę zarówno monocytów MHCII- i MHCII+ (Figura 3a), jak i neutrofili (Supplementary Figure S3d) w obrębie blaszki właściwej po infekcji Hh i blokadzie IL-10R w porównaniu z podobnie leczonymi miotami CD11cIL-23+. Mniejsza infiltracja monocytów u myszy CD11cIL-23- korelowała z większą częstością makrofagów lamina propria, podczas gdy częstości CD11b + DCs i CD103 + DCs były niezmienione, a liczby bezwzględne zostały zmniejszone (Dodatkowa Figura S3d).

Ponieważ IL-23 napędza zapalenie jelit poprzez bezpośredni wpływ na komórki T, promując ich akumulację i proliferację w okrężnicy,29 zbadaliśmy przedział komórek T okrężnicy myszy CD11cIL-23- i CD11cIL-23+ podczas zapalenia okrężnicy. Myszy CD11cIL-23- wykazywały niższą częstotliwość występowania komórek T CD4+ w okrężnicy w porównaniu z ich pobratymcami bogatymi w IL-23 (Figura 3b). Podczas gdy myszy CD11cIL-23+ wytworzyły silną odpowiedź efektorową Th1/Th17 charakteryzującą się pojawieniem się jedno- i podwójnie produkujących IL-17A+/IFNγ+ komórek T, myszy CD11cIL-23- wykazywały tylko łagodną indukcję odpowiednich cytokin (Figura 3c).

Ogólnie rzecz biorąc, brak zapalenia jelita grubego u myszy CD11cIL-23- wskazuje, że produkcja IL-23 przez MNPs wykazujące ekspresję CD11c odgrywa nieredundantną rolę w odpowiedzi zapalnej jelita.

MHCII+ monocyty i makrofagi są głównym źródłem IL-23 po zakażeniu H. hepaticus

Aby lepiej zrozumieć sekwencję zdarzeń związanych z rozwojem zapalenia jelita grubego u myszy z niedoborem IL-23, najpierw monitorowaliśmy ekspresję IL-23 w leukocytach oczyszczonych z okrężnicy propria. Ekspresja mRNA Il23a była konsekwentnie wykrywalna 4-5 dni po rozpoczęciu zapalenia okrężnicy (Figura 4a), co sugeruje, że we wczesną produkcję IL-23 w okrężnicy zaangażowany jest podzbiór komórek rezydujących w tkankach i/lub szybko mobilizowanych. Dlatego wybraliśmy ten punkt czasowy do dalszych analiz. W 4 dni po zakażeniu Hh i leczeniu anty-IL-10R, myszy CD11cIL-23+ wykazywały zwiększoną infiltrację leukocytów w lamina propria w stosunku do niezakażonych myszy kontrolnych (Figura 4b). Ten napływ korelował ze zwiększoną liczbą wszystkich podzbiorów MNP w okrężnicy (Supplementary Figure S4a,b), a także zwiększoną częstotliwością monocytów MHCII- i MHCII+ (Figura 4c,d), neutrofili (Figura 4d), CD103+ CD11b- DCs i CD103+ CD11b+ DCs (Figura 4e). Jednakże częstości makrofagów i CD11b+ DCs wśród wszystkich leukocytów były niezmienione w tym punkcie czasowym (Figura 4

Aby dokładniej scharakteryzować podzbiory mieloidów zaangażowane w zależne od IL-23 zapalenie jelit, zbadaliśmy ekspresję GFP związaną z CD11c-Cre-associated przez komórki lamina propria od myszy CD11cIL-23+. Analiza komórek CD45+ potwierdziła, że ekspresja Cre-GFP była ograniczona do leukocytów wyrażających CD11c na ich powierzchni komórkowej (Figura 4f), ale była głównie obserwowana w komórkach CD11chi. Ponadto fluorescencja GFP związana z Cre była obserwowana tylko w komórkach MHCII+ (Figura 4g) i, co ciekawe, ekspresja mRNA Il23a była ograniczona do komórek Cre-GFP+ (Figura 4h). Większość MNP z lamina propria wykazuje wysoki poziom ekspresji CD11c (Figura 1e i Dodatkowa Figura S1b). Analiza różnych podzbiorów mieloidów u myszy CD11cIL-23+ ujawniła, że ekspresja GFP związana z CD11c-Cre została wykryta głównie wśród makrofagów, CD103+ CD11b- DCs, CD103+ CD11b+ DCs, (Figura 4i) i CD11b+ DCs (nie pokazano). Ponadto, ponad połowa monocytów MHCII+ była pozytywna dla Cre-GFP, wskazując, że wszystkie te podzbiory mogą być potencjalnym źródłem IL-23. W przeciwieństwie do tego, ekspresja Cre była nieobecna w eozynofilach, neutrofilach i monocytach MHCII- (Figura 4i).

Aby scharakteryzować, które z tych podzbiorów stanowią funkcjonalne źródło IL-23 in vivo, oceniliśmy ekspresję Il23a mRNA przez odpowiednie populacje sortowane za pomocą cytometrii przepływowej od myszy CD11cIL-23- i CD11cIL-23+ 4 dni po infekcji Hh w obecności blokady IL-10R. Co uderzające, ekspresja mRNA Il23a w komórkach CD11cIL-23+ była w większości ograniczona do monocytów i makrofagów MHCII+, z niską ekspresją wykrywalną wśród CD103+ CD11b- DCs i CD103+ CD11b+ DCs (Figura 4j). Ponadto ekspresja Il23a zarówno przez monocyty MHCII+, jak i makrofagi była znacznie zmniejszona u myszy CD11cIL-23-, wskazując, że ekspresja CD11c-Cre była aktywna w tych podzbiorach komórkowych (Figura 4j). Niska ekspresja Il23a obserwowana w monocytach MHCII- (Figura 4k) sugeruje, że indukcja IL-23 występuje w lamina propria podczas ich lokalnego dojrzewania i nabywania MHCII.

Ponieważ poziom ekspresji CX3CR1 identyfikuje dyskretne podzbiory MNP, powtórzyliśmy naszą analizę u myszy CX3CR1GFP/+. U niezakażonych myszy wykryto niskie poziomy konstytutywnego Il23a wśród monocytów MHCII+, CD103+ CD11b+ DCs, (Dodatkowa Figura S4c,d) i CD11b+ DCs (Dodatkowa Figura S4d). Jednak zwiększona ekspresja Il23a w 4 dniu po zakażeniu Hh i blokadzie IL-10R była konsekwentnie wykrywana tylko w monocytach MHCII+ (Supplementary Figure S4d) i makrofagach (nie pokazano). Podczas przebiegu zapalenia wysoka ekspresja Il23a utrzymywała się w monocytach MHCII+ i ich potomstwie rozwojowym, ale nie w CD103+ DCs (Figura 5a). Wśród podzbiorów CX3CR1int, ekspresja Il23a była dalej ograniczona do komórek CD64+ (Figura 5b).

Patrząc łącznie, nasze dane wskazują, że indukcja IL-23 w zapaleniu jelita grubego jest zawarta w komórkach CX3CR1-ekspresyjnych CD11c+, które również wyrażają MHCII i CD64.

Batf3-zależne CD103+ DCs są zbędne dla przewlekłego zapalenia jelita grubego

CD103+ CD11b+ DCs występują głównie w jelicie cienkim myszy i są prawie nieobecne w okrężnicy.6 Zamiast tego większość okrężnicy CD103+ DC jest CD11b- i wymaga czynnika transkrypcyjnego Batf3 do ich rozwoju.30 Myszy Batf3-/- pozbawione są zatem rezydujących w tkankach subsetów CD8α+ i CD103+ CD11b- nielimfoidalnych DC. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki CD103+ CD11b- były silnie zredukowane w okrężnicy propria myszy Batf3-/-, podczas gdy CD103+ CD11b+ DCs były niezmienione (Figura 6a,b). Aby ocenić, czy CD103+ CD11b- DCs mogą być zaangażowane w rozwój zapalenia jelita grubego, zainfekowaliśmy myszy Batf3-/- Hh w połączeniu z leczeniem anty-IL-10R. W 2 tygodnie po rozpoczęciu zapalenia jelita grubego, liczba CD103+ CD11b- DCs była nadal znacznie zmniejszona w blaszce właściwej (Figura 6b), ale nie zaobserwowano różnic w nacieku leukocytów (Figura 6c) lub ciężkości zapalenia jelita grubego (Figura 6d) u myszy Batf3-/- w porównaniu z ich odpowiednikami typu dzikiego, co wskazuje, że zależne od Batf3 DCs są zbędne do indukcji zapalenia jelit napędzanego IL-23 w tym modelu.

Dojrzałe makrofagi produkują IL-23 w odpowiedzi na stymulację H. hepaticus in vitro, ale dzielą funkcjonalną redundancję z monocytami MHCII+ in vivo

Aby rozszyfrować udział makrofagów w produkcji IL-23, wygenerowaliśmy makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDMs) od myszy CD11cIL-23- i CD11cIL-23+. Po zróżnicowaniu z pożywką kondycjonowaną komórkami L929, około połowa BMDMs była pozytywna dla Cre-GFP i wykazywała ekspresję CD64, F4/80 i CD11c (Supplementary Figure S5a). BMDMs były stymulowane in vitro żywymi bakteriami Hh w obecności przeciwciała anty-IL-10R, a ich odpowiedź porównano z odpowiednimi kontrolami. Co uderzające, stymulacja CD11cIL-23+ BMDMs z Hh spowodowała ekspresję mRNA Il23a, a ta odpowiedź była wzmocniona w obecności blokady sygnalizacji IL-10R, podczas gdy Il23a nie była wyrażana przez niestymulowane BMDMs lub te traktowane samym przeciwciałem anty-IL-10R (Supplementary Figure S5b). Podobnie, zakażenie myszy tylko Hh indukowało niski wybuch IL-23 w monocytach i makrofagach in vivo, a ta odpowiedź była silnie zwiększona w przypadku braku sygnalizacji IL-10R (Supplementary Figure S5c).

Makrofagi tkanki jelitowej wywodzą się wyłącznie z monocytów krwi i nie ulegają samoodnowieniu.8, 10 Sygnalizacja receptora czynnika stymulującego kolonie 1 (CSF-1R) kontroluje różnicowanie Ly6Chi w monocyty Ly6Clo31 i jest wymagana do dojrzewania i wymiany monocytów Ly6Clo typu rezydującego i makrofagów tkankowych, ale jest zbędna do produkcji monocytów Ly6Chi lub funkcji zapalnej.32. Aby ocenić względny udział monocytów MHCII+ i makrofagów tkankowych w rozwoju zależnego od IL-23 zapalenia jelit, przed indukcją zapalenia jelita grubego podawaliśmy myszom CX3CR1GFP/+ mAb blokujący anty-CSF-1R lub kontrolę izotypową. Grupa myszy została przeanalizowana w dniu 0 (Supplementary Figure S6a,b), podczas gdy pozostałe myszy były traktowane Hh i anty-IL-10R i kontynuowały leczenie anty-CSF-1R. W 4 dni po infekcji Hh i leczeniu anty-IL-10R makrofagi były prawie nieobecne w okrężnicy myszy leczonych anty-CSF-1R. Niejednorodny przedział Ly6Clo CX3CR1int makrofagów/DC był również znacznie zmniejszony u tych myszy (Figura 7a,b i Suplementacyjna Figura S6c). Chociaż całkowita liczba leukocytów okrężnicy pozostała niezmieniona (Figura 7c), nastąpił wzrost odsetka granulocytów w tych warunkach (Figura 7d). Co ciekawe, wyczerpanie makrofagów dodatkowo korelowało ze zwiększoną ekspresją Il23a w obrębie lamina propria w dniu 4 (Figura 7e). Jednakże pozbawienie makrofagów za pośrednictwem anty-CSF-1R w całym przebiegu zapalenia jelita grubego nie wpłynęło na liczbę komórek zapalnych gromadzących się w okrężnicy (Figura 7f) lub nasilenie patologii jelitowej (Figura 7g) 2 tygodnie po infekcji Hh i blokadzie sygnalizacji IL-10R, sugerując, że monocyty i makrofagi MHCII+ mogą wykazywać funkcjonalną redundancję podczas zapalenia.

.