5 Regulation of Intracellular Anion Concentrations
Regulacja stężenia chlorków zależy od koordynacji kilku procesów (Rys. 2). Sugeruje się, że niektóre kanały przecieku chlorków zmniejszają wewnątrzkomórkowe stężenie chlorków, działając jak zawory jednokierunkowe. Pomysł ten wywodzi się z obserwacji, że kanały chlorkowe takie jak ClC-2 (gen clcn2) są bardziej przepuszczalne dla chlorku wychodzącego z komórki niż dla chlorku wchodzącego do komórki.35 Niezależnie od tej różnej przepuszczalności, którą określa się mianem rektyfikacji, kierunek przepływu chlorków nadal zależy od siły napędowej chlorków. Oznacza to, że chlorki rzadko, jeśli w ogóle, będą miały możliwość opuszczenia komórki przez ClC-2, ponieważ siła napędowa chlorków jest prawie zawsze w przeciwnym kierunku. Ponieważ „zawór” jest niedoskonały, kanały ClC-2 w rzeczywistości pozwalają chlorkowi przeciekać do komórki.36
Nieudana próba wypuszczenia chlorku z komórki przez kanały uwypukla potrzebę innych mechanizmów transportu jonów, które mogą przemieszczać chlorki wbrew ich gradientowi.37 Kotransportery, lub symporterzy, przemieszczają dwa lub więcej gatunków jonów w tym samym kierunku przez błonę komórkową; chlorki mogą przemieszczać się wbrew ich gradientowi, podczepiając się pod inny jon, który porusza się w dół ich gradientu. Wymienniki, lub antyportery, robią skutecznie to samo, ale przez sprzężenie ruchu gatunków jonów, które płyną w przeciwnych kierunkach przez błonę. Głównym ekstruderem chlorków w neuronach jest kotransporter potasowo-chlorkowy 2 (KCC2) (gen slc12a5). KCC2 pozwala jonom chlorkowym spychać jony potasowe w dół ich gradientu i opuścić komórkę. Proces ten jest elektronowo neutralny z powodu stechiometrii chlorków i potasu w stosunku 1:1. Proces nie jest aktywny, ponieważ nie obejmuje bezpośrednio hydrolizy ATP (i dlatego nie powinien być określany jako pompowanie); zamiast tego, proces jest wtórnie aktywny, ponieważ KCC2 opiera się na gradiencie potasu, który jest utrzymywany przez ATPazę sodowo-potasową, która pompuje potas do komórki.
Kotransporter sodowo-potasowo-chlorkowy 1 lub NKCC1 (gen slc12a2) jest kolejnym ważnym czynnikiem przyczyniającym się do homeostazy chlorków w neuronach. NKCC1 wykorzystuje gradient sodu do przemieszczania potasu i chlorków do wnętrza komórki, co skutkuje wysokim wewnątrzkomórkowym stężeniem chlorków. Jest to oczywiście przeciwieństwo tego, jak KCC2 wpływa na chlorki. Względna ekspresja NKCC1 i KCC2 dyktuje więc wewnątrzkomórkowe stężenie chlorków, niezależnie od wpływu ładunku chlorków przez różne kanały chlorkowe, w tym aktywowane kanały GABAA i glicynowe. Należy zwrócić uwagę na kilka kwestii. Po pierwsze, NKCC1 ulega silnej ekspresji we wczesnym okresie rozwoju, podczas gdy KCC2 ulega tylko słabej ekspresji, ale następuje przełączenie rozwojowe, które prowadzi do odwrotnego wzorca w wieku dorosłym.38,39 W rogu grzbietowym rdzenia kręgowego szczura Eanion wydaje się osiągać swoją dojrzałą wartość około 2 tygodnie po urodzeniu,40 ale pełna zdolność do ekstruzji chlorków jest osiągana dopiero po 3-4 tygodniach po urodzeniu41; innymi słowy, ładunki chlorków łatwiej obezwładniają ekstruzję chlorków wspomaganą przez KCC2 w młodych neuronach. Po drugie, zmiana rozwojowa nie zachodzi w pierwotnych neuronach aferentnych, co oznacza, że poziom NKCC1 pozostaje wysoki, skutkując wysokim wewnątrzkomórkowym stężeniem chlorków w tych komórkach.42,43 Po trzecie, NKCC1 i KCC2 nie ulegają jednolitej ekspresji nawet w obrębie pojedynczego neuronu, co może prowadzić do wysokiego stężenia chlorków wewnątrzkomórkowych w jednym przedziale (takim jak początkowy odcinek aksonu) i niskiego stężenia chlorków wewnątrzkomórkowych w innych przedziałach (takich jak soma i dendryty).44,45 I wreszcie, normalne poziomy ekspresji KCC2 u dorosłych mogą być patologicznie zmienione (Sekcja 8).
Należy wspomnieć o sposobie prowadzenia zapisów elektrofizjologicznych, ponieważ może to (celowo lub nieumyślnie) prowadzić do zmian w wewnątrzkomórkowym stężeniu chlorków. W technice whole cell patch clamp, błona komórkowa zostaje przerwana w celu uzyskania elektrycznego dostępu do komórki po uszczelnieniu pipety do błony komórkowej; w konsekwencji cytozol jest dializowany z roztworem pipety. Roztwór pipety jest często zaprojektowany tak, aby stężenie chlorków było zbliżone do naturalnego poziomu wewnątrzkomórkowego, ale czasami celowo ma wysokie stężenie chlorków w celu zwiększenia siły napędowej chlorków (np. aby ułatwić wykrywanie małych hamujących prądów postsynaptycznych). Każde z tych podejść jest dopuszczalne w zależności od zadawanego pytania. Jednak w obu przypadkach dializowanie komórki oznacza, że chlorki wewnątrzkomórkowe są skutecznie zablokowane na poziomie lub w pobliżu poziomu chlorków w roztworze pipety, co oczywiście nie jest odpowiednie do pomiaru naturalnego poziomu chlorków w komórce. Ten problem może być rozwiązany przez zastosowanie techniki perforowanej łaty.46 To powiedziawszy, dializowanie komórki może być użyte do badania zdolności do ekstruzji poprzez określenie czy wewnątrzkomórkowe stężenie chlorków wyrównuje się ze stężeniem w pipecie lub czy komórka jest w stanie utrzymać niższy poziom dzięki mechanizmom ekstruzji.47,48 Co więcej, w klamrze napięciowej, potencjał membranowy jest gwałtownie zmieniany i utrzymywany na dowolnie wybranych wartościach, co może prowadzić do bardzo nienaturalnych sił napędzających chlorki. Jak wyjaśnili Ratté i Prescott,36 takie szczegóły eksperymentalne muszą być starannie rozważone, aby uniknąć błędnych interpretacji.
Jak już wspomniano, wodorowęglan wypływa przez aktywowane receptory GABAA i glicyny. Prawdopodobieństwo wypływu wodorowęglanu powodującego akumulację pozakomórkową jest niewielkie, biorąc pod uwagę stosunkowo nieograniczoną dyfuzję wodorowęglanu w przestrzeni pozakomórkowej, ale wypływ wodorowęglanu może wyczerpać wewnątrzkomórkowe poziomy wodorowęglanu i spowodować spadek pH.49. Jednak w normalnych warunkach raczej do tego nie dochodzi, ponieważ wewnątrzkomórkowy wodorowęglan jest uzupełniany poprzez konwersję dwutlenku węgla i wody do wodorowęglanu i protonów przez enzym anhydrazę węglową; jako gaz, dwutlenek węgla swobodnie dyfunduje przez błonę komórkową. Wewnątrzkomórkowy wodorowęglan można zubożyć (i w ten sposób ograniczyć jego odpływ) poprzez zablokowanie anhydrazy węglanowej za pomocą acetazolamidu,32 który w rzeczywistości może mieć działanie przeciwbólowe (rozdział 9). Regulacja pH wiąże się z innymi reakcjami chemicznymi i mechanizmami transportu, a sam wodorowęglan może być przenoszony przez błonę komórkową w zamian za chlor.50
.