Laine nie zajęła się profesjonalnym śpiewaniem aż do połowy lat dwudziestych. Jej wczesne wpływy jako piosenkarka to Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland i Lena Horne. W wieku 24 lat pomyślnie przeszła przesłuchanie do małej grupy Johna Dankwortha, Dankworth Seven, a później do jego orkiestry, z którą występowała do 1958 roku. Dankworth i Laine pobrali się w tym samym roku w tajemnicy w Urzędzie Stanu Cywilnego w Hampstead. Jedynymi świadkami byli przyjaciel pary, pianista Ken Moule, oraz aranżer Dankwortha, David Lindup. Małżeństwo doczekało się dwójki dzieci, którzy oboje są muzykami odnoszącymi sukcesy: Alec, który mieszka w USA, i Jacqui, brytyjska piosenkarka, która wydała kilka albumów.
Zagrała główną rolę w nowej sztuce w londyńskim Royal Court Theatre, domu nowej fali dramaturgów z lat 50. takich jak John Osborne i Harold Pinter. Doprowadziło to do kolejnych występów scenicznych, takich jak musical Valmouth w 1959 roku, sztuka A Time to Laugh (z Robertem Morleyem i Ruth Gordon) w 1962 roku, Boots With Strawberry Jam (z Johnem Neville’em) w 1968 roku, a w końcu do roli Julie La Verne w produkcji Wendy Toye Show Boat w Adelphi Theatre w Londynie w 1971 roku. Show Boat miał swój najdłuższy bieg do tej pory w tym sezonie w Londynie z 910 spektakli wystawionych.
W tym okresie, miała dwa główne sukcesy nagraniowe. „You’ll Answer to Me” osiągnęło brytyjski Top 10, podczas gdy Laine była „primadonną” w produkcji Edinburgh Festival w 1961 roku opery/baletu Kurta Weilla The Seven Deadly Sins, w reżyserii i choreografii Kennetha MacMillana. W 1964 roku jej album Shakespeare and All that Jazz z Dankworthem został dobrze przyjęty. Dankworth i Laine założyli teatr Stables w 1970 roku w dawnym budynku stajni na terenie ich domu. Był to natychmiastowy sukces, z 47 koncertów w pierwszym roku.
Międzynarodowa działalność Laine rozpoczęła się w 1972 roku, z udanej pierwszej trasy koncertowej w Australii, gdzie wydała sześć top-100 albumów w ciągu 1970 roku. Wkrótce potem jej kariera w Stanach Zjednoczonych rozpoczęła się od koncertu w nowojorskim Lincoln Center, po którym w 1973 roku nastąpił pierwszy z wielu występów w Carnegie Hall. Wkrótce potem nastąpiły trasy koncertowe po Stanach Zjednoczonych i Kanadzie, a wraz z nimi kolejne albumy płytowe i występy w telewizji, w tym w The Muppet Show w 1977 roku. Po kilku nominacjach do nagrody Grammy, którą otrzymała za nagranie koncertu w Carnegie w 1983 roku. Nadal okresowo koncertuje, w tym w Australii w 2005 roku.
Współpracowała z Jamesem Galwayem, Nigelem Kennedym, Julianem Lloyd Webberem i Johnem Williamsem. Innymi ważnymi nagraniami w tym czasie były albumy w duecie z Rayem Charlesem (Porgy and Bess) oraz Pierrot Lunaire Arnolda Schoenberga, za który otrzymała nominację do nagrody Grammy.
Związek Laine z teatrem muzycznym rozpoczął się w Wielkiej Brytanii i był kontynuowany w Stanach Zjednoczonych, gdzie wystąpiła w rolach głównych w A Little Night Music Sondheima i Wesołej wdówce Franza Lehára (Michigan Opera). W 1980 roku wystąpiła w Colette, musicalu Dankwortha. Przedstawienie rozpoczęło się w teatrze Stables, Wavendon, w 1979 roku i zostało przeniesione do Comedy Theatre, Londyn, we wrześniu 1980 roku. W 1985 roku zagrała rolę księżniczki Puffer w broadwayowskim musicalu The Mystery of Edwin Drood, za którą otrzymała nominację do nagrody Tony. W 1989 roku otrzymała uznanie krytyków z Los Angeles za rolę Czarownicy w Into the Woods Sondheima.
W maju 1992 roku Laine wystąpiła z Frankiem Sinatrą na tygodniowym koncercie w Royal Albert Hall w Londynie.
Do końca lat 90. koncerty Laine wyprzedawały się na całym świecie, zwykle wspierane przez Dankwortha z jego zespołem, orkiestrą lub mniejszą grupą. Jej zwykły zespół obejmował John Horler (fortepian), Alec Dankworth (bas), Allan Ganley (perkusja) i Mark Nightingale (puzon).
Autobiografia Laine, Cleo, została opublikowana we wrześniu 1994 roku przez Simon & Schuster. Jej druga książka, You Can Sing If You Want To, została opublikowana przez Victor Gollancz w październiku 1997 roku. W 2000 roku pojawiła się jako wokalistka Gwen w filmie The Last of the Blonde Bombshells.
W 1997 roku na liście New Year’s Honours, Laine została Dame Commander, a ona została mianowana Dame Cleo Laine DBE. W 2006 roku na liście New Year’s Honours, jej mąż został kawalerem, stając się Sir John Dankworth. Byli jedną z niewielu par, gdzie oboje partnerzy posiadali swoje tytuły w ich własnym prawem i tylko para w jazzie być uznane w ten sposób.
Dankworth zmarł w dniu 6 lutego 2010 roku, godziny przed planowanym koncertem w teatrze Stables w Wavendon z okazji 40-lecia miejsca. Był chory od kilku miesięcy po trasie koncertowej w Stanach Zjednoczonych. Pomimo żałoby, Laine wystąpiła na koncercie z okazji 40-lecia, wraz z John Dankworth Big Band i kilkoma członkami swojej rodziny – informując o jego śmierci dopiero na końcu. Decyzja Laine o występie znalazła się na pierwszych stronach gazet na całym świecie, w tym pełne zdjęcie na pierwszej stronie The Times.
Tydzień po śmierci Dankwortha, Laine zastąpiła zmarłego męża i ponownie wystąpiła na koncercie w Pinner w północno-zachodnim Londynie. Laine nadal występowała i udzielała wywiadów w miesiącach następujących po śmierci Dankwortha. Pojawiła się jako główny akt na festiwalu Music in the Garden w Wavendon w czerwcu i lipcu 2010.
W marcu 2010 roku, Laine i Dankworth ostatnia współpraca muzyczna została wydana na CD i do pobrania – Jazz Matters. Nagranie zawierało Dankworth Big Band grający nowe kompozycje napisane przez Dankwortha na występ pary podczas Proms 2007 w Royal Albert Hall.
Laine jest znana nie tylko ze swojego stylu interpretacji, ale także z prawie czterooktawowego zakresu i zdolności adaptacji wokalnej. Poza głębokimi, soulowymi nutami, Laine wyróżnia się również skatem i górnymi tonami, które stały się jej znakiem rozpoznawczym. Choć jej naturalna gama to kontralt, jest w stanie wydobyć G powyżej wysokiego C. Derek Jewel z Sunday Times nazwał ją „po prostu najlepszą śpiewaczką na świecie”
.