Chimera była stworzeniem w mitologii greckiej zwykle przedstawianym jako połączenie lwa, kozy i węża. Współczesne użycie terminu „chimeryzm” w transplantacji komórek krwiotwórczych wywodzi się z tej idei „mieszanej” jednostki, odnoszącej się do kogoś, kto otrzymał przeszczep z genetycznie różnej tkanki. Badanie chimeryzmu po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych obejmuje identyfikację profili genetycznych biorcy i dawcy, a następnie ocenę stopnia wymieszania we krwi, szpiku kostnym lub innej tkance biorcy.
Testowanie chimeryzmu (analiza przeszczepienia) za pomocą DNA wykorzystuje metodologię powszechnie stosowaną w badaniu tożsamości człowieka i jest wykonywane poprzez analizę polimorfizmów genomowych zwanych loci z krótkimi powtórzeniami tandemowymi (STR). Lokalizacje te składają się z głównej sekwencji DNA, która powtarza się zmienną liczbę razy w obrębie dyskretnego locus genetycznego. Termin STR, określany również jako mikrosatelity, odnosi się do liczby par zasad powtarzającej się tandemowo sekwencji DNA, której długość waha się od 2 do 8 par zasad. Lokalizacje te wykazują allele, które mogą różnić się długością między osobnikami i są dziedziczone jako kodominujące cechy mendlowskie. Lokalizacje STR zostały zidentyfikowane w całym ludzkim genomie, a niektóre z nich mają ponad 25 alleli.
Informacja o sekwencji DNA w konserwatywnych regionach flankujących loci jest wykorzystywana do tworzenia oligonukleotydowych par starterów dla STR. Startery te są wykorzystywane w amplifikacji PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy) próbek testowych. Technika ta może amplifikować sekwencję STR nawet miliard razy, dając materiał, który może być rozdzielony za pomocą żelu elektroforetycznego lub metodą elektroforezy kapilarnej (CE). Genotypowanie odbywa się poprzez ocenę wielkości fragmentów DNA. Odniesienie do drabiny allelicznej może być wykorzystane do dokładnej identyfikacji alleli STR.
System STR/CE oparty na PCR ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami analizy. Amplifikacja wielu loci STR może być połączona (multipleksowana) w pojedynczej probówce, umożliwiając analizę do szesnastu loci w jednej reakcji. Ponieważ wymagane są niewielkie ilości DNA, można wykorzystać próbki o niskiej liczbie komórek, a mały rozmiar alleli STR umożliwia nawet wykorzystanie zdegradowanych próbek DNA. Dane cyfrowe ułatwiają analizę i archiwizację, a proces CE jest zarówno szybki, jak i efektywny kosztowo. Amplifikacja PCR i analiza loci STR zapewnia szybką i wiarygodną metodę oceny statusu przeszczepu w warunkach transplantacji komórek macierzystych.
Obecnie stosowana technologia umożliwia koamplifikację i trójkolorową detekcję szesnastu loci, które są podzielone na 3 zestawy po 5 lub 6 loci, które wykazują amplifikowane fragmenty o nienakładających się zakresach wielkości.
Podczas etapu amplifikacji PCR amplifikowane fragmenty są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi. Po amplifikacji PCR, próbki są przetwarzane w systemie elektroforezy kapilarnej (CE).
Analiza danych jest ułatwiona dzięki oprogramowaniu do analizy fragmentów, które wymiaruje fragmenty DNA przy użyciu wewnętrznego standardu pasa biegnącego z próbką i przypisuje genotypy przez porównanie z drabinką alleli STR zawartą w przebiegu CE. W ten sposób uzyskuje się odrębne profile genotypowe STR dla dawcy i biorcy przeszczepu. Lokalizacje STR, które są polimorficzne (tj. informacyjne) między tymi osobami są wykorzystywane do oceny względnych ilości DNA biorcy i dawcy w próbce potransplantacyjnej.
Próbki testowane mogą pochodzić z dowolnego materiału zawierającego DNA, w tym szpiku kostnego, krwi obwodowej, guzów litych, tkanki naskórkowej, mieszków włosowych, wymazów z policzków i frakcjonowanych podzbiorów komórek. Ponieważ amplifikacja PCR próbki jest rutynowo wykonywana z mniej niż 2 ng genomowego DNA (odpowiednik około 300 komórek), badanie chimeryzmu tą metodą może być z powodzeniem wykonywane nawet u pacjentów z niewydolnością przeszczepu, ciężką leukopenią lub z frakcji podzbiorów komórek krwiotwórczych. Analiza STR została wykorzystana do oceny statusu przeszczepienia u pacjentów, którzy otrzymali przeszczep komórek krwiotwórczych, w tym u pacjentów otrzymujących podwójne jednostki krwi pępowinowej lub drugi przeszczep od innego dawcy; jak również do potwierdzenia tożsamości genetycznej domniemanych bliźniąt jednojajowych oraz do wykrycia przeszczepienia komórek matczynych pochodzących z okresu in-utero u pacjentów z rozpoznaniem ciężkiego mieszanego niedoboru odporności (SCID). Analiza STR/CE jest szybką, wiarygodną, dokładną i powtarzalną procedurą.
Ograniczenia testu
- Wystarczająca ilość DNA musi zostać wyizolowana z badanych próbek, aby umożliwić solidną amplifikację PCR. Metody izolacji DNA muszą być dostępne w celu obsługi próbek o niskiej liczbie komórek, takich, jakie można napotkać u biorców z niewydolnością przeszczepu oraz z sortowanych podzbiorów krwinek białych specyficznych dla linii cytometrii przepływowej. Próbki mogą mieć stężenia zbyt niskie do oznaczenia ilościowego metodą spektrofotometrii UV OD260. Próbki DNA z 5,000 do 30,000 wyizolowanych komórek niezawodnie zapewniają akceptowalną amplifikację. Laboratorium posiada wytyczne określające, kiedy należy powtórzyć analizę próbki.
- W przypadku zestawów komercyjnych, wiele loci STR posiada allele informacyjne zarówno dla dawcy, jak i biorcy w przypadku dawcy niespokrewnionego. Jednakże liczba informatywnych loci STR może być ograniczona do zaledwie 3 wśród par przeszczepów od dawców spokrewnionych. Stwierdzono, że wartości ilościowe reprezentujące średnią z zaledwie 3 loci STR są powtarzalne.
- Pacjenci z chorobami złośliwymi mogą mieć mutacje klonalne, które wpływają na pewne loci STR. Allele pacjenta mogą być nieobecne w jednym lub więcej loci STR, gdy porównuje się allele zidentyfikowane w próbce pacjenta przed przeszczepem z próbką po przeszczepie. W rzadkich okolicznościach można wykryć dodatkowy allel STR pacjenta w określonym locus, który nie był obecny w próbce pobranej przed przeszczepem. W większości przypadków takie anomalie są prawdopodobnie wynikiem translokacji chromosomowych. Brakujące allele mogą być również wynikiem mutacji w obrębie konserwatywnych sekwencji flankujących STR, w których znajdują się primery PCR. Dane z loci STR z brakującymi lub dodatkowymi allelami nie są wykorzystywane do kwantyfikacji.
- Jeśli komórki pacjenta przed przeszczepem nie są dostępne, próbki takie jak wymazy z policzków, biopsja skóry lub cebulki włosów mogą być pobierane po przeszczepie. Należy jednak zauważyć, że próbki policzkowe mogą zawierać znaczne ilości komórek dawcy.
- Test nie jest przeznaczony do wykrywania minimalnej choroby resztkowej.
Kliniczne wskazania do badania chimeryzmu w przeszczepie komórek krwiotwórczych
Rutynowo prowadzona po przeszczepie dokumentacja pochodzenia dawcy/biorcy białych krwinek we krwi obwodowej i/lub szpiku. Dokumentacja przeszczepienia może obejmować badanie specyficznych dla linii komórkowej podzbiorów komórek, takich jak CD3 dodatnie limfocyty T i CD33 dodatnie komórki mieloidalne.
Ocena komórek dawcy/biorcy u pacjentów z nieodpowiednią czynnością szpiku.
Określić, czy nawrót lub nowy nowotwór złośliwy pochodzi z komórek biorcy lub dawcy.
Ocena ryzyka prognostycznego odrzucenia i nawrotu nowotworu złośliwego.
Dokumentować utrzymywanie się komórek dawcy po przeszczepieniu u pacjentów z nawrotem choroby lub przed infuzją limfocytów dawcy (DLI).
Ocena, czy wystąpiło odrzucenie przeszczepu u biorców, którzy są kandydatami do drugiego przeszczepu.
Różnicowanie pochodzenia komórek dawcy u biorców, którzy otrzymali drugi przeszczep od innego dawcy lub przeszczep z podwójnymi jednostkami krwi pępowinowej.
Wykrywanie obecności komórek pochodzących od matki u pacjentów, u których zdiagnozowano ciężki połączony niedobór odporności (SCID).
Weryfikacja tożsamości genetycznej domniemanych bliźniąt jednojajowych.
Często zadawane pytania
Pytanie: W jaki sposób analizuje się dawców wielokrotnych?
Odpowiedź: Niezbędna jest identyfikacja loci STR, które wykazują co najmniej jeden unikalny allel STR dla pacjenta i każdego dawcy.
Pytanie: Dlaczego badany jest matczyny engraftment?
Odpowiedź: U pacjentów, u których zdiagnozowano ciężki połączony niedobór odporności (SCID), mogło dojść do przeszczepienia komórek krwiotwórczych pochodzenia matczynego w okresie płodowym. Niektóre specyficzne dla linii krwi podzbiory komórek (szczególnie komórki CD3-dodatnie) mogą być głównie lub całkowicie pochodzenia matczynego.
Pytanie: Jaka jest różnica między chimeryzmem „pełnym” a „mieszanym”?
Odpowiedź: „Pełny” chimeryzm jest używany w odniesieniu do pacjenta, który wykazuje fenotyp po przeszczepie w komórkach krwiotwórczych, które są w całości pochodzenia dawcy.
„Mieszany” chimeryzm odnosi się do pacjenta, który wykazuje mieszaninę fenotypu pacjenta i dawcy w komórkach krwiotwórczych po przeszczepie.
Pytanie: Co zrobić, jeśli próbka wyjściowa biorcy nie jest dostępna?”
Odpowiedź: Dostępnych jest kilka opcji uzyskania próbki biorcy po przeszczepie: próbki z chusteczki policzkowej, korzenia włosa lub biopsji skóry mogą być użyte do uzyskania próbki wyjściowej biorcy. Próbki wymazu z policzka powinny być używane z ostrożnością, ponieważ komórki dawcy mogą być obecne w znaczących ilościach w próbkach wymazu z policzka.
Pytanie: Co zrobić, jeśli próbka wyjściowa od dawcy nie jest dostępna?
Odpowiedź: Jeśli dawca żyje, należy uzyskać nową próbkę krwi. Jeśli dawca nie żyje, próbki po przeszczepie należy porównać z próbkami pacjenta sprzed przeszczepu, aby zidentyfikować allele STR, które są wykrywane, ale nie pochodzą od pacjenta.
Pytanie: Dlaczego HLA nie jest realnym środkiem do monitorowania biorstwa?
Odpowiedź: Dawcy przeszczepów są dobierani tak, aby byli jak najdokładniej dopasowani do biorcy. Nie ma żadnych markerów HLA różnicujących biorcę i dawcę, gdy są oni dopasowani, a tylko jeden lub dwa, gdy są niedopasowani. Dodatkowo, inne technologie są często bardziej czułe do tego celu niż monitorowanie niedopasowanych alleli HLA; w konsekwencji, inne loci są używane do zapewnienia unikalnych profili.
Pytanie: Co to jest informacyjny locus STR?
Odpowiedź: Jest to locus z co najmniej jednym allelem unikalnym dla biorcy lub dawcy. Aby być użytecznym w obliczeniach chimeryzmu, locus musi mieć allele unikalne dla obu. W przypadku przeszczepu od dawcy niespokrewnionego może istnieć duża liczba informatywnych loci, natomiast w przypadku dobranego rodzeństwa jest ich bardzo mało. Ze względu na różnice w efektywności amplifikacji alleli w każdym locus, preferowane jest uzyskanie wartości średnich lub mediany z kilku loci w celu zwiększenia dokładności. Wyniki z poszczególnych loci są niezawodnie powtarzalne, więc nawet jeden locus może być użyty do trendowania próbek sekwencyjnych.
Pytanie: Co to jest locus „amelogenin”, który jest zawarty w niektórych panelach amplifikacyjnych?
Odpowiedź: Gen amelogeniny zlokalizowany jest na chromosomach X i Y. Nie jest to STR, ale wykazuje różne rozmiary produktów na odpowiednich chromosomach. Dzięki temu jest przydatny do określania płci. Jest on włączony do panelu primerów przez komercyjnych dostawców zestawów skierowanych do społeczności kryminalistycznej, gdzie rozróżnianie X/Y jest szeroko stosowane. Generalnie nie jest on używany do analizy chimeryzmu, ponieważ nie może zapewnić unikalnego markera żeńskiego (próbka męska zawsze zawiera allel X); nie jest też pomocny przy ocenie próbek po przeszczepie komórek macierzystych dopasowanych do płci.
Pytanie: Czym różni się analiza chimeryzmu STR od genotypowania?
Odpowiedź: „Genotyp” odnosi się do poszczególnych alleli obecnych w określonym locus. Genotypowanie jest wykonywane w celu ustalenia profilu biorcy i dawcy w badaniu chimeryzmu. Kiedy analiza chimeryzmu jest wykonywana po przeszczepie komórek macierzystych, profile genotypowe biorcy i dawcy są porównywane z profilem próbki po przeszczepie, aby ocenić, ile każdego składnika jest obecne.
Genotypowanie jest również wykorzystywane w innych scenariuszach, takich jak kryminalistyka i badanie ojcostwa. Analitycy kryminalistyczni używają genotypów do identyfikacji źródła dowodów w sprawach karnych i do wykluczania ludzi z rozważań jako podejrzanych. Mogą oni również identyfikować szczątki ludzkie w sprawach „NN” i w masowych katastrofach. Oznaczenia rodzicielstwa są wykonywane w podobny sposób, aby wykluczyć kogoś jako możliwego rodzica poprzez znalezienie alleli obecnych w dziecku, które nie pasują ani do matki, ani do domniemanego ojca.
Literatura cytowana/zalecana
Bryant E, Martin PJ. Documentation of engraftment and characterization of chimerism following hematopoietic cell transplantation. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hematopoietic cell transplantation. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.