Dideoksynukleotyd

Zahamowanie ataku nukleofilowego z powodu braku grupy 3′-OH

Metoda Sangera jest stosowana do amplifikacji docelowego odcinka DNA, dzięki czemu możliwe jest precyzyjne określenie sekwencji DNA. Włączenie ddNTPs do zaworów reakcyjnych służy po prostu do zakończenia syntezy rosnącej nici DNA, w wyniku czego powstają częściowo zreplikowane fragmenty DNA. Dzieje się tak, ponieważ polimeraza DNA potrzebuje 3′ grupy OH rosnącego łańcucha i 5′ grupy fosforanowej przybywającego dNTP do utworzenia wiązania fosfodiestrowego. Czasami polimeraza DNA włączy ddNTP, a brak 3′ grupy OH przerwie reakcję kondensacji pomiędzy 5′ fosforanem (po rozszczepieniu pirofosforanu) przybywającego nukleotydu z 3′ grupą hydroksylową poprzedniego nukleotydu na rosnącej nici. Taka reakcja kondensacji zachodzi zwykle po przyłączeniu niemodyfikowanego dNTP przez polimerazę DNA. W najprostszym ujęciu, nukleofilowy atak grupy 3′ OH prowadzi do przyłączenia nukleotydu do rosnącego łańcucha. Brak 3′ grupy hydroksylowej hamuje ten nukleofilowy atak, wyłączając zdolność polimerazy DNA do kontynuowania swojej funkcji.

To odkrycie doprowadziło do jego odpowiedniej nazwy „Chain-terminating nucleotides”. Didexyribonucleotides nie mają 3′ grupy hydroksylowej, stąd nie dalsze wydłużenie łańcucha może wystąpić raz to didexynucleotide jest na łańcuchu. Może to prowadzić do zakończenia sekwencji DNA. Tak więc, cząsteczki te stanowią podstawę metody sekwencjonowania DNA z terminacją łańcucha dideoksynukleotydów, która została opisana przez Fredericka Sangera i jego zespół w 1977 roku jako rozwinięcie wcześniejszych prac. Metoda Sangera została opisana w 2001 r. jako jedna z dwóch podstawowych metod sekwencjonowania fragmentów DNA (drugą jest metoda Maxama-Gilberta), ale metoda Sangera jest zarówno „najszerzej stosowana, jak i stosowana przez większość automatycznych sekwenatorów DNA”. Sanger otrzymał swoją drugą Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1980 roku, dzieląc ją z Walterem Gilbertem („za ich wkład dotyczący określania sekwencji zasad w kwasach nukleinowych”) i z Paulem Bergiem („za jego fundamentalne badania biochemii kwasów nukleinowych, ze szczególnym uwzględnieniem rekombinowanego DNA”), i omówił wykorzystanie dideoksynukleotydów w swoim wykładzie noblowskim.

Sekwencjonowanie DNAEdit

Dideoksynukleotydy są użyteczne w sekwencjonowaniu DNA w połączeniu z elektroforezą. Próbka DNA poddawana PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy) w mieszaninie zawierającej wszystkie cztery deoksynukleotydy i jeden dideoksynukleotyd wytworzy pasma o długości równej pozycji każdej zasady typu, który uzupełnia typ mający obecny dideoksynukleotyd. Polimeraza taq używana w PCR faworyzuje ddGNTP, co jest wzorem obserwowanym w różnych badaniach. Oznacza to, że każda baza nukleotydowa tego konkretnego typu ma prawdopodobieństwo związania się nie z deoksynukleotydem, ale raczej z dideoksynukleotydem, co kończy wydłużanie łańcucha. Dlatego też, jeśli próbka zostanie poddana elektroforezie, obecne będzie pasmo dla każdej długości, przy której obecne jest dopełnienie dideoksynukleotydu. Obecnie powszechne jest stosowanie fluorescencyjnych dideoksynukleotydów, tak że każdy z czterech ma inną fluorescencję, która może być wykryta przez sekwenator; w ten sposób potrzebna jest tylko jedna reakcja.

.

Dodaj komentarz