Sanes i Lichtman użyli iniekcji pronuklearnej, aby wprowadzić te konstrukty Brainbow do myszy. Kiedy obrazowali mózgi myszy, znaleźli o wiele więcej niż 3-4 kolory z powodu tandemowej integracji wielu kopii konstruktu (około 8 u myszy Brainbow-1.0.) Kombinatoryczny efekt wielu niezależnych zdarzeń rekombinacji prowadzi do powstania tęczy kolorów. Przy trzech kopiach konstruktu można by się spodziewać dziesięciu kolorów (patrz tabela po prawej); w różnych doniesieniach Sanes i Lichtman zaobserwowali od 90 do 160 odrębnych kolorów dzięki większej liczbie kopii. Nazwa Brainbow jest naprawdę odpowiednia dla tej kolorowej technologii.
Optymalizacja systemu: Brainbow-3
Ale Brainbow dostarczył neuronaukowcom ogromną gamę kolorów potrzebnych do oznaczania poszczególnych neuronów, system ten cierpiał również z powodu szeregu ograniczeń. Po pierwsze, obrazowanie tkanki myszy Brainbow stanowiło wyzwanie ze względu na niską intensywność fluorescencji, spowodowaną częściowo foto-stabilnością fluoroforów, jak również tendencją fluoroforów do agregacji w somatach neuronów. Po drugie, system ten nie pozwalał na analizę poprzez barwienie immunologiczne. Chociaż użyte fluorofory są fluorescencyjnie różne, ich sekwencje białkowe są wysoce homologiczne, co uniemożliwia zaprojektowanie przeciwciał specyficznych dla każdego fluoroforu. Po trzecie, Brainbow-1 i Brainbow-2 zawierały stan „domyślny”; na przykład, Brainbow-1.0 wyraża RFP, gdy konstrukt nie przeszedł rekombinacji. Ten domyślny stan był nieproporcjonalnie wyrażany przez większość neuronów, ograniczając liczbę różnych kolorów, które można było zaobserwować w danym obszarze.
W 2013 roku Dawen Cai, et al. wypuścili udoskonalenie technologii Brainbow, Brainbow-3.0, mając na celu pokonanie ograniczeń wymienionych powyżej. Z siedmiu otrzymanych białek wybrali trzy o niskim poziomie zarówno fluorescencji, jak i nakładania się sekwencji (koralowiec mOrange2, meduza EGFP i ukwiał morski mKate2). Następnie z powodzeniem wygenerowali własne przeciwciała dla każdego z tych białek i potwierdzili brak reaktywności krzyżowej, co otworzyło drzwi do analizy immunostarbingu. Aby uzyskać równomierne znakowanie komórek, wygenerowali farnezylowane pochodne białek fluorescencyjnych, które są bezpośrednio transportowane do błon komórkowych. Przemieszczanie się przez błony farnezylowanych pochodnych umożliwia znakowanie delikatnych procesów aksonalnych i dendrytycznych, które wcześniej nie były widoczne przy użyciu Brainbow-1 i -2.
Ogólna struktura Brainbow-1.0 jest zachowana w Brainbow-3.0, ale z mOrange2, EGFP i mKate2 jako fluoroforami; mOrange2 jest stanem domyślnym. Z kolei Brainbow-3.1 i -3.2 nie wykazują domyślnej fluorescencji z powodu dodania kasety STOP blokującej translację bezpośrednio za promotorem. Kaseta STOP zawiera mutant YFP, który nie fluoryzuje, ale może być wykryty przez barwienie immunologiczne. Ta cecha ułatwia badania przesiewowe Cre-negatywnych myszy Brainbow w celu określenia liczby i typu komórek, w których dochodzi do ekspresji konstruktu. Fotostabilność Brainbow-3.2 jest poprawiona dzięki dodaniu posttranskrypcyjnego elementu regulacyjnego (WPRE) wirusa zapalenia wątroby kaczki leśnej, powszechnie stosowanego do zwiększania poziomu białka transgenu.
Warianty Brainbow i zastosowania poza mózgiem myszy
Oprócz udoskonalenia systemu Brainbow, Sanes i Lichtman opracowali również komplementarny konstrukt Flpbow, który jest funkcjonalnie podobny do Brainbow opartego na Cre, ale jest kontrolowany przez rekombinazę FLP/FRT. Po umieszczeniu pod różnymi promotorami, Brainbow i Flpbow mogą być używane do znakowania różnych populacji komórek.
Aby zmniejszyć hodowlę zwierząt konieczną do produkcji zwierząt z transgenami Brainbow i Cre, Cai et al. stworzyli również konstrukt Autobow zawierający zarówno Cre jak i XFP. Produkcja Cre napędza rekombinację i selekcję XFP, po której następuje samowykluczenie Cre. Konstrukty te są stabilnie utrzymywane przez co najmniej sześć pokoleń.
Oprócz neuronalnych konstruktów pThy1-Brainbow, Addgene posiada również dwa wektory Brainbow adeno-associated viral (AAV) – AAV-EF1a-BbChT i AAV-EF1a-BbTagBY. Konstrukty te zawierają po dwa XFP ze względu na ograniczenia wielkości związane z AAV; współzakażenie obydwoma konstruktami daje minimum 8 kolorów. Zastosowanie AAV zapewnia kontrolę przestrzenną i czasową bez potrzeby modyfikacji germinalnej i umożliwia stosowanie Brainbow u różnych gatunków.
Więcej wariantów zostało stworzonych przez inne laboratoria, w tym R26R-Confetti opisany w Hugo J. Snippert, et al. (2010) i strategia MAGIC Marker opisana w Karine Loulier, et al. (2014).
Obecnie techniki Brainbow są również stosowane do badania organizmów modelowych, takich jak Drosophila i zebrafish. Brainbow w Drosophila pomogła w mapowaniu obwodów neuronalnych, takich jak połączenia między neuronami ruchowymi i złączem nerwowo-mięśniowym. U zeberek metoda ta stała się bardzo przydatna w śledzeniu linii rozwojowych; „Zebrabow” został wykorzystany do śledzenia rozwoju nabłonka rogówki.
Dla naukowców zainteresowanych neuronauką i rozwojem, Brainbow jest cennym narzędziem do oznaczania i śledzenia pojedynczych komórek ze względu na szeroki wachlarz i wysoką stabilność kolorów. Sanes i Lichtman szacują, że kolorowe znakowanie Brainbow skróciło czas mapowania dla danego fragmentu mózgu o co najmniej rząd wielkości. Jest jasne, że dalsze udoskonalanie techniki Brainbow zapewni istotny wgląd w skomplikowaną fizyczną organizację mózgu i innych układów biologicznych.
Zainteresowany zastosowaniem Brainbow w swoich badaniach? Sprawdź plazmidy Brainbow dostępne w Addgene!
Znajdź plazmidy Brainbow @Addgene:
- Plazmidy Brainbow 1.0, 1.1, 2.1
- Plazmidy Brainbow 3.0, 3.1, 3.2
Transgeniczne strategie kombinatorycznej ekspresji białek fluorescencyjnych w układzie nerwowym. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
A technicolour approach to the connectome. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
Intestinal krypty homeostazy wynika z neutralnej konkurencji między symetrycznie dzielących się komórek macierzystych Lgr5. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: a recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Ulepszone narzędzia dla zestawu narzędzi Brainbow. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
.