Functions of Danggui Buxue Tang, a Chinese Herbal Decoction Containing Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix, in Uterus and Liver are Both Estrogen Receptor-Dependent and -Independent

Abstract

Danggui Buxue Tang (DBT), napar ziołowy zawierający Astragali Radix (AR) i Angelicae Sinensis Radix (ASR), jest stosowany w leczeniu nieregularności menopauzalnych u kobiet od ponad 800 lat w Chinach. Wyniki badań farmakologicznych wykazały, że DBT wykazuje znaczące właściwości estrogenne in vitro, co sugeruje, że DBT może aktywować jądrowe receptory estrogenowe. Tutaj ocenialiśmy właściwości estrogenne DBT w modelu szczurzym in vivo, po ovariektomii: DBT stosowano u szczurów poddanych ovariektomii przez 3 dni. Zastosowanie DBT nie wpłynęło na masę macicy i wątroby, jak również na ekspresję transkryptu markerów proliferacji, w tym receptorów estrogenowych α i β. DBT stymulowała jednak ekspresję transkryptu genów reagujących na estrogeny. Ponadto potwierdzono indukcyjną rolę DBT na ekspresję członków rodziny receptorów węglowodorów arylowych w macicy i wątrobie szczurów poddanych ovariektomii. Te reakcje na DBT różniły się jednak wyraźnie od wzorca odpowiedzi wykrytego tutaj dla 17β-estradiolu. Dlatego DBT wykazywała słabe, ale znaczące właściwości estrogenne in vivo; jednakże niektóre z jej działań były niezależne od receptora estrogenowego. Tak więc, DBT może być ekscytującym chińskim ziołowym wywarem do alternatywnego leczenia hormonalnej terapii zastępczej dla kobiet w okresie menopauzy bez późniejszych estrogennych skutków ubocznych.

1. Wprowadzenie

Tradycyjne leki chińskie (TCM) są stosowane jako leki lub suplementy diety w Chinach od ponad tysiąca lat. Historycznie, TCMs są przygotowywane jako wywary przez unikalną metodologię z określonymi kombinacjami różnych ziół jako formuły. Wśród tysięcy receptur ziołowych, Danggui Buxue Tang (DBT) jest prostym naparem ziołowym, składającym się z dwóch ziół. DBT został po raz pierwszy opisany w Neiwaishang Bianhuo Lun przez Li Dongyuan w Chinach w AD 1247. Li opisał, że formuła DBT powinna zawierać 10 qian Astragali Radix (AR), korzeni Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge lub Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungevar. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao, oraz dwa qian Angelicae Sinensis Radix (ASR), korzeni Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Jeden qian równa się około 3 gramom. DBT jest przepisywana kobietom w Chinach jako środek na objawy menopauzy, który poprawia ich zdrowie poprzez podnoszenie „Qi” (energii życiowej) i odżywianie „krwi” (krążenia ciała).

Kobiety w okresie menopauzy cierpią na uderzenia gorąca, pocenie się, niepokój i wahania nastroju, jak również na zwiększone ryzyko wielu problemów zdrowotnych, takich jak utrata masy gęstości kości (osteoporoza) i choroby sercowo-naczyniowe. Problemy te wynikają w dużej mierze z niedoboru hormonów jajnikowych, zwłaszcza estrogenów. Hormonalna terapia zastępcza (HRT) była stosowana w celu złagodzenia objawów menopauzalnych przez wiele lat, ale leczenie to wiązało się z efektami ubocznymi, tj. zwiększonym ryzykiem raka piersi, zawałów serca i udarów mózgu. W świetle tych zagrożeń klinicznych, wiele wysiłku poświęcono na poszukiwanie lub opracowanie nowych leków, które przyniosłyby korzyści terapii hormonalnej, ale przy minimalnym ryzyku. TCM, zawierająca tysiące ziół leczniczych, jest obiecującym zasobem, który mógłby zapewnić doskonałe rozwiązanie. Rzeczywiście, niektóre z produktów ziołowych wykazały wyraźną skuteczność w zakresie objawów menopauzalnych i w konsekwencji były szeroko stosowane przez kobiety w celu złagodzenia objawów menopauzalnych, na przykład DBT . Eksperymenty in vitro z komórkami gruczołu sutkowego i komórkami wywodzącymi się z kości sugerują, że przynajmniej część skuteczności DBT jest pośredniczona przez mechanizmy zależne od receptora estrogenowego (ER-). W celu potwierdzenia tych obserwacji in vivo, DBT była badana w modelu szczura Wistar po owariektomii pod kątem potencjalnych właściwości estrogennych. Ponieważ DBT jest naparem, który tradycyjnie jest spożywany jako herbata, zwierzętom podawano DBT w wodzie pitnej. Stosując takie podejście, przeprowadziliśmy trzydniowe badanie uterotroficzne w celu wykrycia reakcji istotnych dla wyjaśnienia molekularnych mechanizmów działania DBT, w tym masy narządów i regulacji ekspresji genów.

2. Materiały i Metody

2.1. Materiały roślinne i przygotowanie DBT

Trzyletni AR pochodzący z korzeni A. membranaceus var. mongholicus zebrano z prowincji Shanxi , a dwuletni ASR z A. sinensis pochodził z Minxian w prowincji Gansu . Te materiały roślinne zostały morfologicznie potwierdzone przez Dr. Tina Dong, podczas zbierania w terenie. Odpowiednie vouchery jako formy całych roślin, voucher # 02-9-1 dla ASR i voucher # 02-10-4 dla AR, zostały zdeponowane w Center for Chinese Medicine, The Hong Kong University of Science and Technology. 17β-Estradiol (E2) otrzymano z Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy). 250 g pokrojonego AR i 50 g pokrojonego ASR zmieszano (stosunek 5 : 1), a następnie gotowano w 2400 mL (w : v = 1 : 8) wody przez 2 godziny, po czym wywar przefiltrowano. Pozostałości gotowano w 1,800 mL (w : v = 1 : 6) wody przez 1 godzinę. Połączone ekstrakty suszono w próżni i przechowywano w temperaturze -20°C. Wykazano, że ta ekstrakcja, po starożytnym przygotowaniu, jest najlepszym warunkiem ekstrakcji. Dwa markery chemiczne w AR (kalkozyna i formononetyna) oraz dwa inne w ASR (kwas ferulowy i ligustylid) zostały użyte do standaryzacji właściwości chemicznych DBT. Standaryzowana DBT powinna zawierać nie mniej niż 0,186 mg kalikozyny, 0,155 mg formononetyny, 0,351 mg kwasu ferulowego i 0,204 mg ligustylidu na jeden g suchej masy DBT, jak podano poprzednio .

2.2. Zwierzęta

Juletnie samice szczurów Wistar ( g) uzyskano od Harlan Winkelmann (Borchen, Niemcy) i utrzymywano w kontrolowanych warunkach temperatury (20°C ± 1, wilgotność względna 50-80%) i oświetlenia (12 godzin światła, 12 godzin ciemności). Wszystkie szczury miały swobodny dostęp do standardowej diety dla szczurów (SSniff R10-Diet, SSniff GmbH, Soest, Niemcy) i wody. Wszystkie warunki hodowli zwierząt i obchodzenia się z nimi były zgodne z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee w Niemczech.

2.3. Test uterotroficzny

Estrogenność badano w teście 3-dniowym u szczurów poddanych owariektomii zgodnie z wytyczną OECD 440 . Procedury doświadczalne są schematycznie podsumowane na Rysunku 1. Krótko mówiąc, po ovariektomii i 14-dniowym spadku endogennych hormonów, zwierzęta poddawano działaniu preparatu przez 3 dni. Zwierzęta zostały losowo przydzielone do grupy leczonej ekstraktami ziołowymi, grupy kontroli pozytywnej lub grupy nośnika (). DBT podawano doustnie w dawkach 0,01 g/kg BW/d lub 1 g/kg BW/d oraz E2 (1 μg/kg BW/d; iniekcja podskórna), która służyła jako kontrola pozytywna. Zwierzęta uśmiercano przez dekapitację po lekkim znieczuleniu z inhalacją CO2. Określono mokrą masę macicy i wątroby. Macice i wątroby zamrożono w ciekłym azocie do przygotowania RNA.

2.4. Total RNA Preparation and Reverse Transcription

Całkowite cytoplazmatyczne RNA ekstrahowano z macicy szczura standardową metodą TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY). Pozostałości DNA usuwano enzymatycznie przez trawienie (Deoxyribonuclease I, Ambion, Foster City, CA), a usunięcie sprawdzano metodą PCR. Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) i Oligo (dT) 12-18 zostały użyte do syntezy pierwszej nici cDNA.

2.5. Ilościowy Real-Time PCR

Ilościowy real-time PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA Platinum Taq (Invitrogen) z wykorzystaniem termocyklera iCycler z systemem detekcji iQ real-time. Reakcje prowadzono trzykrotnie w trzech powtórzeniach. Po worteksowaniu, do każdej studzienki 96-studzienkowej cienkościennej płytki PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) nanoszono pipetą porcje 50 μL mieszaniny. Reakcje PCR składały się z pierwszego cyklu denaturującego w 95°C przez 3 min, po którym następowało 50 cykli po 10 s w 95°C, 15 s w 60°C i 30 s w 72°C. Fluorescencję oznaczano ilościowo pod koniec etapu wyżarzania w 60°C, a tożsamość produktu potwierdzano analizą krzywej topnienia (60-95°C). Sekwencje primerów i rozmiary amplikonów są podsumowane w Tabeli 1 w Materiałach Uzupełniających dostępnych online na stronie http://dx.doi.org/10.1155/2014/438531. Względne ilości mRNA genów docelowych obliczono po normalizacji do endogennego genu referencyjnego (podjednostka 1 oksydazy cytochromu C, COX1). Wyniki wyrażono jako względne ilości mRNA w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi przy użyciu wzoru .

2,6. Analiza statystyczna

Analiza statystyczna danych w tej pracy została przeprowadzona przy użyciu dwukierunkowej analizy wariancji, a następnie porównania parami wybranych średnich przy użyciu testu Studenta. Kryterium istotności ustalono na , , i w porównaniu do kontroli.

3. Wyniki

3.1. Body Weight and Organ Wet Weights

Odpowiedź uterotroficzną u szczurów ovariectomizowanych mierzono po 3 dniach leczenia farmakologicznego. DBT stosowano w dwóch dawkach 0,01 (DBT0,01) i 1 (DBT1) g/kg BW/d. Jako kontrolę pozytywną zastosowano E2 w dawce 1 μg/kg BW/d, a jako kontrolę negatywną nośnik – olej rycynowy. Te zabiegi nie miały wpływu na masę ciała zwierząt (rysunek 2(a)). W odniesieniu do mokrej masy ciała, leczenie E2 przez 3 dni spowodowało znaczący, ponad 5-krotny wzrost mokrej masy macicy, ale nie miało wpływu na masę wątroby (rysunek 2(b)). Leczenie DBT, dla obu stężeń DBT0,01 i DBT1, nie miało wpływu na masę macicy i wątroby (Figura 2(b)). Obserwacja ta była zgodna z ekspresją mRNA Ki-67, czułego markera proliferacji w macicy, która jednak pozostała niezmieniona po leczeniu DBT (Rycina 2(c)). Ekspresja mRNA Ki-67 jest silnie stymulowana w odpowiedzi na leczenie E2 (Figura 2(c)). W wątrobie, żaden z zabiegów nie spowodował statystycznie istotnego wpływu na ekspresję Ki-67 (Figura 2(c)).

(a)

(b)

(c)
(a)
(b)
(c)

3.2. Estrogen-Associated Gene Expression in Uterus and Liver

Ekspresję mRNA ERα i ERβ wykryto w macicy szczura we wszystkich warunkach leczenia. Po leczeniu E2, mRNA ERα i ERβ wykazywały oczekiwaną znaczącą redukcję, w porównaniu do zwierząt kontrolnych, podczas gdy zastosowanie DBT nie miało wpływu na ekspresję mRNA ERα i ERβ (Figura 3(a)). W przypadku działania ER w macicy znane są pewne bardzo czułe geny markerowe, które monitorują odpowiedzi estrogenowe, tj. dopełniacz C3 (C3), białko wiążące wapń 9 kDa (CaBP9k) i klastyna (Clu). W macicy traktowanie E2 powodowało kilkusetkrotny wzrost ekspresji mRNA kodującego C3 i CaBP9k, przy jednoczesnym znacznym obniżeniu ekspresji mRNA Clu (Rycina 3(b)). Najwyraźniej DBT była zdolna do wywołania bardzo łagodnej (nieprzekraczającej 5-krotnej), regulowanej przez ER regulacji genów C3 i CaBP9k. Wyższa dawka DBT powodowała obniżenie ekspresji mRNA Clu, które nie osiągnęło poziomu istotności statystycznej ze względu na wysokie odchylenie standardowe wartości średniej (Rycina 3(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

W wątrobie szczura we wszystkich warunkach leczenia wykryto ekspresję mRNA ERα. Odpowiedź autoregulacyjna obniżenia poziomu ERα przez E2 nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej, podczas gdy oba stężenia DBT obniżały poziom mRNA ERα w stanie stacjonarnym w sposób istotny statystycznie (Figura 4(a)). Aby ocenić ekspresję genów odpowiedzi zależnych od ERα w wątrobie, oznaczono poziom ekspresji odpowiednich genów odpowiedzi ER specyficznych dla wątroby, tj. CaBP9k i białka wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu I (IGFBP1). Leczenie E2 spowodowało wzrost ekspresji mRNA CaBP9k i spadek ekspresji mRNA 1GFBP1 w wątrobie (Rycina 4(b)). Leczenie dużą dawką DBT (DBT1) istotnie zmniejszało ekspresję IGFBP1. Zwiększona ekspresja CaB9k została ujawniona po leczeniu DBT w obu stężeniach, ale w obu przypadkach nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej ze względu na zmienność (Rycina 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

3.3. Lipid Metabolism-Associated Gene Expression in Liver

Ponieważ uważa się, że DBT zwiększa „Qi”, zbadaliśmy ekspresję genów związanych z metabolizmem lipidów. Będąc głównym miejscem metabolizmu lipidów, funkcjonowanie wątroby jest związane z otyłością, która z kolei jest czynnikiem ryzyka dla chorób narządów hormonozależnych, takich jak rak piersi. Dlatego też zbadaliśmy ekspresję apolipoproteiny A-I (Apo-A1) jako głównego składnika HDL-cholesterolu oraz receptorów aktywowanych proliferatorami peroksysomów (PPAR), które reprezentują sensory lipidowe i są w różny sposób zaangażowane w regulację metabolizmu energetycznego. Zwiększenie aktywności PPARα przez DBT nie osiągnęło poziomu istotności statystycznej. W odniesieniu do PPARγ, DBT w stężeniu 1 g/kg BW/d obniżyła ekspresję jego mRNA (Rycina 5(a)). Obniżenie to było podobne do tego wywołanego przez E2. Natomiast efektem, który był wyraźnie niezależny od potencjalnych właściwości estrogennych DBT, było wyraźne obniżenie ekspresji mRNA PPARδ przez obie dawki DBT (Rycina 5(a)). Wyniki te wyraźnie wskazują na fakt, że DBT może regulować ekspresję receptorów ściśle zaangażowanych w regulację dostępności i zużycia energii z tłuszczu poprzez modulację ekspresji receptorów z rodziny PPAR. Regulacja metabolizmu cholesterolu, jako potencjalny związek z powikłaniami zespołu metabolicznego, jest przedmiotem zainteresowania. Dlatego też ocenialiśmy regulację ekspresji mRNA Apo-A1. Wzorzec ekspresji wskazuje na estrogenopodobne właściwości DBT w stężeniu 1 g/kg BW/d, która podobnie jak E2 obniżyła ekspresję mRNA Apo-A1.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Rycina 5

Ekspresja genów receptorów aktywowanych proliferatorami peroksysomów i Apo-A1.aktywowanych receptorów i Apo-A1 w wątrobach. (a) Ekspresję mRNA PPARα, PPARγ i PPARδ w wątrobach analizowano za pomocą ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym. (b) Ekspresja mRNA Apo-A1 w wątrobach była analizowana ilościową analizą real-time PCR. Gwiazdki oznaczają wartości istotnie różniące się od odpowiednich kontroli. , , i .

3.4. The Regulation of DBT on Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway in Uterus and Liver

Efektywna detoksykacja jest również kluczowa dla zdrowia. Wiadomo, że receptor węglowodorów arylowych (AHR) wyzwala ekspresję enzymów metabolizujących/detoksykujących w wątrobie i innych tkankach, które działają w sposób skoordynowany z baterią enzymów regulowanych przez Nrf2. Tutaj zbadaliśmy ekspresję AhR, członków rodziny AhR i genów reagujących na AhR w macicy i wątrobie pod wpływem DBT w porównaniu do E2. Ogólnie rzecz biorąc, wykryliśmy specyficzną dla tkanki regulację ekspresji AhR, członków rodziny AhR i genów odpowiedzi po leczeniu DBT.

W macicy, ekspresja mRNA AhR była silnie obniżona w odpowiedzi na E2, podczas gdy żadna zmiana nie była widoczna w odpowiedzi na DBT (Figura 6(a)). Ekspresja mRNA translokatora jądrowego receptora węglowodorów arylowych 1 (ARNT 1), ko-regulatora AHR, była obniżona przez E2, podczas gdy DBT w wysokiej dawce prowadzi do podwyższenia poziomu mRNA ARNT1 w tym narządzie. Jeśli chodzi o ARNT2, to w macicy w odpowiedzi na leczenie E2 doszło do silnego obniżenia ekspresji mRNA, efekt ten nie był wykrywalny w odpowiedzi na DBT (Rycina 6(b)). Cytochrom P450 (rodzina 1) A1 (Cyp1A1) i Glutationowe-S-transferazy Ya (GST-Ya) są uważane za bardzo czułe geny odpowiedzi na funkcję AhR. Poziomy mRNA Cyp1A1 w macicy były silnie obniżone przez E2, efekt ten był również wykrywalny w odpowiedzi na obie dawki DBT, ale w mniejszym stopniu (Rycina 6(c)). Ekspresja mRNA GST-Ya była podwyższona tylko w odpowiedzi na E2. Leczenie DBT w obu dawkach nie miało wpływu na ekspresję mRNA GST-Ya w macicy (Figura 6(c)).
(a)
(b)
(c)

W wątrobie, w odpowiedzi na leczenie E2 wykryto łagodną, nieistotną statystycznie regulację mRNA AhR, podczas gdy DBT silnie indukowała ekspresję mRNA AhR do ponad 3-krotnej wartości (Figura 7(a)). Poziom mRNA ARNT1 mógł być indukowany tylko przez niską dawkę DBT, ale nie przez E2 i wysoką dawkę DBT. Ponadto, wszystkie trzy zabiegi spowodowały wzrost ekspresji mRNA ARNT2, jednak żadna z wartości nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej (Rysunek 7(b)). Leczenie E2 spowodowało łagodną, ale nieistotną regulację poziomu mRNA Cyp1A1, podczas gdy DBT obniża ekspresję mRNA Cyp1A1 w sposób zależny od dawki. Przeciwnie, leczenie E2 nie spowodowało zmiany ekspresji mRNA GST-Ya, podczas gdy DBT w wysokiej dawce obniżyła ekspresję mRNA GST-Ya w sposób statystycznie istotny, zależny od dawki (Figura 7(c)).
(a)
(b)
(c)

4. Dyskusja

Chociaż DBT wykazywała potencjalne działanie estrogenne in vitro , informacje na temat potencjalnej aktywności hormonalnej DBT in vivo są ograniczone. Wiadomo, że proliferacja komórek endometrium jest pod kontrolą estrogenów i że ryzyko raka endometrium wzrasta wraz z estrogenową terapią zastępczą. Dodatkowo, ponieważ naturalne związki o aktywności estrogenopodobnej często wykazują właściwości selektywne narządowo in vivo, ocenialiśmy eksperyment uterotroficzny przeprowadzony w sposób zależny od narządu. Ocenialiśmy potencjalne efekty DBT w macicy, jako narządzie układu rozrodczego reprezentującym klasyczny narząd docelowy działania estrogenów, oraz w wątrobie jako głównym miejscu metabolizmu, będącym jednym z narządów wykazujących dominującą ekspresję ERα. Dlatego, aby zbadać wpływ DBT przy braku endogennych estrogenów, użyliśmy owariektomizowanych samic szczurów do oceny selektywności ER DBT w macicy i wątrobie.

Wyniki wykazały, że DBT nie zmieniała mokrej masy macicy i wątroby ani poziomu ekspresji markerów proliferacji i ER w żadnej z badanych dawek. W przypadku działania ER w macicy znane są pewne bardzo czułe geny markerowe, które wychwytują odpowiedzi estrogenowe, tj. wzrost ekspresji C3 i CaBP9k oraz spadek ekspresji Clu. C3 i CaBP9k mogły być podkręcone przez E2, podczas gdy Clu było podkręcone w odpowiedzi na leczenie E2 w macicy. DBT bardzo łagodnie naśladowała odpowiedzi estrogenowe dla C3 i CaBP9k, ale nie dla Clu. Jest to o tyle interesuj±ce, że upregulacja C3 i CaBP9k obejmuje elementy odpowiedzi ERE, podczas gdy dokładny mechanizm downregulacji Clu przez ER nie jest znany. Jednakże, odzwierciedlaj±c miejsca wi±ż±ce czynniki transkrypcyjne zawarte w promotorze Clu, prawdopodobny jest udział procesów SP1- i AP-mediowanych przez ER. Równolegle w wątrobie stwierdzono zmiany ekspresji CaBP9k i IGFBP1 jako markerów odpowiedzi estrogenowej, chociaż ogólna odpowiedź była zdecydowanie niższa niż ta wykrywalna dla CaBP9k czy C3 w macicy. W wątrobie DBT ponownie wykazywała słabe właściwości estrogenne w 3-dniowym teście uterotroficznym. Efekty były wykrywalne tylko przy użyciu najbardziej czułych markerów ekspresji genów działania estrogenów.

Wątroba jest ponadto głównym miejscem metabolizmu lipidów, który jest związany z otyłością i który z kolei jest czynnikiem ryzyka dla chorób w narządach hormonozależnych, takich jak rak piersi. Dlatego zbadaliśmy ekspresję Apo-A1 jako głównego składnika HDL-cholesterolu i receptorów PPAR, które są w różny sposób zaangażowane w regulację metabolizmu energetycznego. Są one również znanymi celami dla związków naturalnych, a wiązanie się z nimi poprawia np. wychwyt glukozy. Uzyskane przez nas wyniki jednoznacznie wskazują, że DBT poprzez modulację ekspresji receptorów z rodziny PPAR może przyczyniać się do regulacji dostępności i wykorzystania energii z tłuszczu. Liczne prace przeglądowe podsumowują regulację szlaków metabolicznych w następstwie aktywacji PPAR, co nie jest przedmiotem zainteresowania niniejszej pracy. Jednakże, dwie cechy naszych wyników dotyczących PPAR zasługują na omówienie. Zaobserwowano silną downregulację PPARδ w odpowiedzi na DBT. W związku z tym należy wspomnieć, że PPARδ reagował na leczenie DBT w sposób pozornie niezależny od estrogenów/ER. Funkcjonalne konsekwencje obniżenia ekspresji PPARδ przez DBT muszą pozostać otwarte w tym miejscu; nie jest to jednak spowodowane autoregulacyjną obniżką PPARδ po związaniu składników DBT, ponieważ DBT nie stymulowała ani PPARδ, ani zależnej od PPARγ aktywacji genów reporterowych w teście transfekcji przejściowej (dane nie pokazane). Jednak aktywacja kaskady sygnałowej zależnej od PPARδ przez DBT byłaby interesująca, ponieważ PPARδ jest głównym regulatorem mobilizacji tłuszczu i wydatkowania energii z tłuszczu i z powodu tego fenotypu potencjalnie związanego z otyłością i jej zapobieganiem.

W przeciwieństwie do tego, PPARγ, przynajmniej w wysokiej dawce DBT, odpowiedział w sposób estrogenopodobny, ulegając redukcji. Ważną cechą PPARγ, oprócz jego właściwości uwrażliwiających na insulinę, jest to, że determinuje on los mezenchymalnych komórek macierzystych. Szkieletowe działanie PPARγ jest w międzyczasie dobrze poznane. Aktywuje on różnicowanie adipogeniczne, hamując tym samym różnicowanie osteogeniczne. Sytuacja ta byłaby niekorzystna dla kobiet w okresie menopauzy, dlatego też obniżenie PPARγ przez DBT może wskazywać na korzystny efekt.

Od dawna wiadomo, że szlak AhR wyzwala ekspresję enzymów metabolizujących w wątrobie i innych tkankach, głównie w sposób skoordynowany z baterią enzymów regulowanych przez Nrf2, przyczyniając się w ten sposób do procesu detoksykacji. Ostatnio wykazaliśmy, że istnieje związek między funkcją estrogenów a regulacją AhR i kaskadą sygnalizacji członków AhR w macicy. Dlatego też zbadaliśmy porównawczo regulację ekspresji AhR, członków rodziny AhR i genów odpowiedzi AhR w macicy i wątrobie przez DBT w porównaniu z estradiolem. Po pierwsze, potwierdziliśmy estrogenowy wzór odpowiedzi członków baterii genów AhR. W przypadku leczenia DBT wykryliśmy ogólnie specyficzną dla tkanki regulację ekspresji AhR, członków rodziny AhR i genów odpowiedzi po leczeniu DBT. Cyp1A1 i GST-Ya, oprócz tego, że są członkami enzymów metabolicznych pierwszego (Cyp1A1) i drugiego przejścia (GST-Ya), są uważane za bardzo wrażliwe geny odpowiedzi w odniesieniu do mechanizmów krzyżowania się szlaków AhR i ER i tutaj również były badane. Interesuj±c± obserwacj± jest fakt, że leczenie DBT wykazało estrogenopodobny wzór odpowiedzi dla regulacji ekspresji Cyp1A1, ale nie dla GST-Ya, co wskazuje na fakt, że działanie DBT w w±trobie jest zwi±zane zarówno z wła¶ciwo¶ciami estrogenopodobnymi, jak i estrogenoniezależnymi. To samo dotyczy prawdopodobnie odpowiedzi wyzwalanych przez AhR. W przyszłości interesujące będzie sprawdzenie, czy DBT i/lub jej składniki wyzwolą aktywność genów reporterowych wywołaną przez AhR.

Dodatkowo, chociaż słabo, stwierdziliśmy, że cząsteczki ARNT są pobudzane przez DBT w wątrobie. Jest to interesujące, ponieważ niektórzy z autorów zaangażowanych w tej pracy niedawno opisał upregulation HIF1α przez DBT ostatecznie prowadzi do upregulation erytropoetyny . ARNT1 jest również nazywany HIF1β i reprezentuje heterodimerycznego partnera dimeryzacji HIF1α w pośredniczeniu w jego jądrowych odpowiedziach. Innymi słowy, pokazujemy tutaj, że DBT reguluje nie tylko HIF1α, ale także HIF1β/ARNT1, tym samym potencjalnie wspierając wpływ HIF1α na erytropoezę.

Podsumowując, po raz pierwszy pokazaliśmy, że DBT reguluje poziomy mRNA członków kaskady sygnalizacyjnej AhR, tym samym wykazując zarówno estrogenopodobne, jak i niezależne od receptora estrogenowego działania, przypuszczalnie prowadzące do odmiennego wzorca mechanizmów detoksykacji. Ostatnim ważnym wynikiem było stwierdzenie, że efekty DBT wydają się być selektywne narządowo, wpływając na funkcje istotne dla zdrowia w okresie menopauzalnym. Jeśli chodzi o bezpieczeństwo, to nie stwierdzono, aby estrogenozależna stymulacja proliferacji w obrębie narządów układu rozrodczego była wskazana. W odniesieniu do skuteczności DBT wykazuje słabe właściwości estrogenne i reguluje ekspresję funkcjonalnie powiązanych sensorów lipidowych obejmujących m.in. rodziny cząsteczek PPAR i AhR, z których ta ostatnia jest powiązana z detoksykacją i metabolizmem energetycznym. Stawiamy hipotezę, że DBT może mieć właściwości, które bezpośrednio i pośrednio wpływają na zdrowie menopauzalne.

Skróty

Konflikt interesów

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów dotyczący publikacji tej pracy.

Podziękowania

This research was supported by Grants from Research Grants Council of Hong Kong (HKUST 6419/06 M and N_HKUST629/07, 662608), Croucher Foundation (CAS-CF07/08.SC03) to Karl W. K. Tsim, and German Research Foundation (DFG Vo410/6-5) and German Academic Exchange Service (DAAD 50023165) to Günter Vollmer. Autorzy z TU-Dresden przyznają wsparcie German Research Foundation oraz Open Access Publication Funds of the TU-Dresden.

Materiały uzupełniające

.