Kanały jonowe i transportery chlorkowe: od ciekawostek natury i źródeł ludzkich chorób do celów farmakologicznych

To zadowala praktycznie każdy przypadek od klasy do laboratorium badawczego, dopóki nie rozważymy kanałów chlorkowych. Wiemy, że istnieją, są ważne i mogą stanowić dobre cele dla leków w kilku obszarach chorobowych, ale do niedawna pozostawały nieco napiętnowane i niemodne w świecie terapeutyki. Brak selektywnych ligandów wcale w tym nie pomagał. Jedynym wyjątkiem jest receptor GABA-A, który jest sprzężony z wewnętrznym kanałem chlorkowym, który otwiera się po związaniu hamującego neuroprzekaźnika GABA. Benzodiazepiny wzmacniają ten receptor od czasu, gdy w latach 60. ubiegłego wieku dostępne stało się Valium, zapewniając działanie uspokajające i przeciwdrgawkowe. Wprowadza to ważną koncepcję: istnieje kilka rodzin genów i różne typy białek, które można opisać jako kanały chlorkowe.

Jest to w przeciwieństwie do tego, co rozumiemy o kationoselektywnych kanałach jonowych, gdzie istnieje niewielka elastyczność w strukturze białka, która może tworzyć por, który jest selektywny dla potasu, sodu lub wapnia; różnorodność tych kanałów jonowych jest spowodowana przez różnice w domenach białkowych odrębnych od porów, które wpływają na zachowanie otwarcia-zamknięcia. Prawdę mówiąc, nie wydaje się, by istniało wiele fizjologicznych powodów, dla których kanał anionowy miałby wykazywać selektywność chlorkową, jako że nie odgrywa on zbyt dużej roli w transporcie błonowym innych halogenków lub małych anionów; z fizjologicznego punktu widzenia każdy kanał anionowy będzie domyślnie kanałem chlorkowym. Z drugiej strony, prądy błonowe potasu, sodu i wapnia odgrywają różne fundamentalne role, a selektywna przepuszczalność błony dla tych kationów jest kluczowa dla funkcji komórkowej i samego życia.

Receptory GABA-A są członkami rodzin cys-pętli pentamerycznych kanałów jonowych bramkowanych ligandami, które obejmują kilka typów pobudzających i hamujących kanałów bramkowanych neuroprzekaźnikami. Białko CFTR (ang. cystic fibrosis transmembrane regulator) jest regulowanym nukleotydami kanałem chlorkowym. Jest ono członkiem zróżnicowanej rodziny transporterów ABC (ATP-binding cassette) i jako jedyne nie transportuje żadnych substratów przez błonę, lecz funkcjonuje jako kanał chlorkowy. Rodzina CLC napięciowo bramkowanych kanałów chlorkowych wywodzi się z innej odrębnej rodziny genów i ma ogóln± strukturę unikaln± w¶ród białek błonowych. Ta rodzina białek przyniosła wiele niespodzianek w ciągu ostatnich 30 lat i członkowie tej rodziny zostaną tutaj przedstawieni, a także w jaki sposób mogą być uważani za cele dla leków.

Inne ekscytujące osiągnięcia w dziedzinie kanałów chlorkowych pojawiły się po molekularnej identyfikacji białek leżących u podstaw kanałów chlorkowych aktywowanych wapniem (ClCa). Funkcjonalnie, wiemy o ich fizjologicznych rolach od jakiegoś czasu, ale niedawna molekularna identyfikacja białek kanału pozwoliła na rozwój molekularnych i farmakologicznych narzędzi do sondowania i zmiany ich aktywności. Niniejszy przegląd skupia się na farmakologicznym potencjale ukierunkowania na kanały ClCa i białka CLC; ich funkcję i lokalizację subkomórkową podsumowano na rycinie 1.

Wprowadzenie do białek CLC

Dziewięciu członków tej rodziny białek to CLC-1 do 7, CLC-KA i KB. Członek założyciel, CLC-1, jest napięciowo bramkowanym kanałem chlorkowym mięśni szkieletowych i zostanie omówiony poniżej. Wiele badań funkcjonalnych przeprowadzono na homologu o honorowym tytule CLC-0, wyizolowanym z narządu elektrycznego Electroplax, który umożliwia płaszczce ogłuszanie swoich wodnych ofiar. Rekonstytucja CLC-0 w dwuwarstwach lipidowych i elektrofizjologiczna rejestracja prądów płynących przez pojedyncze kanały jonowe ujawniła intrygującą właściwość. Zazwyczaj, podczas rejestracji prądu z małego fragmentu błony zawierającego pojedynczy kanał jonowy, obserwuje się fluktuacje pomiędzy dwoma amplitudami prądu: jedną reprezentującą zamknięty kanał i drugą reprezentującą prąd płynący przez otwarty kanał. Fluktuacje te odzwierciedlają przejścia pomiędzy otwartymi i zamkniętymi stanami kinetycznymi. W przypadku CLC-0 okazało się jednak, że pojedyncze białko kanału jonowego składa się z dwóch równoważnych porów, które mogą otwierać się niezależnie1. Kanał ten został więc określony jako dwupory (Rysunek 2). Nie było więc wielkim zaskoczeniem, że struktury krystaliczne homologów z bakterii jelitowych ujawniły, że kompleks białkowy był dimerem, z każdą podjednostką posiadającą ścieżkę przewodzenia jonów2 (Rysunek 2).

Drugie zaskoczenie pojawiło się, gdy przeprowadzono szczegółowe eksperymenty funkcjonalne na CLC-ec1 z E. coli. Zamiast funkcjonować jako kanał chlorkowy, jak jego dawno zaginiony krewny w mięśniach szkieletowych kręgowców, CLC-ec1 jest transporterem wymiany 2Cl-/H+, lub antyporterem, ze ścisłą stechiometrią wymiany 2:13. Białko to jest ważne dla przetrwania bakterii jelitowych w niskim pH4 i prawdopodobnie wykorzystuje gradient chlorków do utrzymania pH komórkowego na tolerowanym poziomie. Dlatego prokariotyczne CLC mogą być celem dla inhibitorów w leczeniu patogennych zakażeń E. coli lub Salmonella4. Odkrycie zachowania jonowymiennego naturalnie pobudziło dalsze wysiłki w celu ustalenia, czy taka wymiana chlorków na protony istnieje w CLC ssaków, przy założeniu, że wymiana Cl-/H+ może być prawdziwą funkcją archetypowych CLC, a te zidentyfikowane jako kanały chlorkowe mogą być jedynie wyjątkami od reguły. Wydaje się, że tak właśnie jest, ponieważ istnieją mocne dowody na to, że CLC-3 do CLC-7 funkcjonują jako transportery wymiany 2Cl-/H+, głównie rezydujące w organellach wewnątrzkomórkowych, podczas gdy CLC-1, CLC-2, KA i KB są prawdziwymi kanałami jonowymi przewodzącymi chlorki w błonie plazmatycznej5-9. Ponieważ archetypową właściwością CLC jest transport wymienny, występujący we wszystkich formach życia komórkowego, ta ostatnia podklasa białek, bona fide kanały chlorkowe, może być zatem uważana za „złamane” transportery chlorkowe, które utraciły sprzężenie transportu chlorku z ruchem drugiego jonu substratowego.

CLC-1

Ten założyciel rodziny CLC jest napięciowo bramkowanym kanałem chlorkowym mięśni szkieletowych i służy do regulacji potencjału błonowego i repolaryzacji błony w następstwie potencjałów czynnościowych w celu rozluźnienia mięśnia. W większości tkanek spodziewalibyśmy się, że kanały potasowe będą odgrywały tę rolę, co ma miejsce w mięśniu sercowym i mięśniach gładkich, jak również regulują pobudliwość błon w innych typach komórek. System kanalików poprzecznych stanowi przedłużenie błony plazmatycznej (sarkolemy) i wnika do wnętrza tkanki kurczliwej. Jest on krytyczny dla szybkiego rozprzestrzeniania się aktywności elektrycznej w całym mięśniu i orkiestruje szybki i kontrolowany skurcz. Odpływ potasu z komórek mięśniowych do zamkniętej przestrzeni t-tubuli spowodowałby wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia potasu i załamanie gradientu jonowego, co prowadziłoby do przedłużonej depolaryzacji błony. Z kanałami chlorkowymi odgrywającymi dominującą rolę w repolaryzacji, jest to uniemożliwione. Mutacje utraty funkcji w CLC-1 prowadzą do miotonii u ludzi, kóz i myszy (ostatni przegląd zobacz10) i charakteryzuje się upośledzoną relaksacją mięśni, zgodną z utratą repolaryzującego prądu membranowego.

Z ekspresją ograniczoną do mięśni szkieletowych, CLC-1 może być atrakcyjnym celem dla leków, które kontrolują skurcz mięśni poprzez zwiększenie lub zmniejszenie funkcji CLC-1, a tym samym zmniejszają lub zwiększają pobudliwość mięśni, odpowiednio. Związki zwiększające funkcję CLC-1 mogą być przydatne w leczeniu miotonii, szczególnie w przypadkach, gdy mogą kompensować częściową utratę aktywności kanału chlorkowego. Inhibicja CLC-1 mogłaby obniżyć próg skurczu mięśni i może być przydatna w przypadku osłabienia mięśni lub chorób zwyrodnieniowych, takich jak dystrofia mięśniowa.

CLC-2

Kanał chlorkowy wewnętrznie rektyfikujący, CLC-2, ma nieco rozległą dystrybucję tkankową. Można go znaleźć w neuronach centralnych, gdzie reguluje aktywność neuronów11-13. W astrocytach jego ukierunkowanie subkomórkowe do połączeń komórkowych jest regulowane przez interakcję z GlialCAM (MLC1), której mutacje zaburzają to ukierunkowanie i powodują leukoencefalopatię megalencefaliczną14. Najnowsze zainteresowania terapeutyczne dotyczą ekspresji CLC-2 w błonie śluzowej jelit i oskrzeli płucnych, gdzie odgrywa ona rolę odpowiednio w wydzielaniu jelitowym i płucnym. Lubiproston, lek stosowany klinicznie w celu łagodzenia zaparć, miał wywierać swój wpływ poprzez aktywację CLC-2, ale efekt ten jest kontrowersyjny. Podczas gdy w niektórych badaniach związek ten aktywuje kanały CLC-2, w innych reguluje trafficking CLC-2 i zwiększa funkcję CFTR poprzez aktywację receptorów prostaglandynowych15,16. Istnieją jednak wystarczające dowody na to, że zwiększenie funkcji CLC-2 w drogach oddechowych może stanowić alternatywny szlak chlorkowy w mukowiscydozie17.

CLC-KA/KB

Te kanały chlorkowe ulegają ekspresji w nabłonku nerkowym i przyczyniają się do przepuszczalności błon komórkowych dla biernego przepływu chlorków. Odgrywają one kluczową rolę w kanalikach wstępujących i dystalnych nefronu, zapewniając bazolateralną drogę reabsorpcji chlorków, po transporcie z moczu pierwotnego przez błonę koniuszkową. Gen CLCKB, który koduje CLC-KB, jest jednym z pięciu genów leżących u podłoża zespołu Barttera. Utrata funkcji mutacji w CLC-KB skutkuje wadliwą reabsorpcją chlorków, co prowadzi do zaburzeń związanych z niedoborem soli i wielomoczem. Jedną z głównych cech osób dotkniętych mutacjami CLC-KB (typ III choroby Barttera) jest niskie ciśnienie krwi. Cięższa postać choroby jest spowodowana mutacjami w genie BSND (typ Barttera IV), który koduje Barttynę, białko pomocnicze ważne dla trasportu zarówno CLC-KA, jak i KB do błony plazmatycznej18. Ta postać zaburzenia obejmuje również głuchotę czuciową, która, jak się uważa, jest spowodowana utratą trajektorii zarówno CLC-KA, jak i KB do błon nabłonkowych w uchu wewnętrznym. Przypuszczalnie, utrata aktywności CLC-KA lub KB, ale nie obu, może być tolerowana przez układ słuchowy. Sugeruje to, że inhibitory selektywne dla CLC-KA lub CLC-KB, lub częściowe hamowanie obu, mogą działać jako nowe diuretyki pętlowe z potencjałem obniżania ciśnienia krwi i z niewielkimi efektami ubocznymi. Doprowadziło to do zbadania ich farmakologii i opracowania nowych pochodnych inhibitorów o niskim powinowactwie mikromolarnym19, które wykazywały działanie moczopędne po podaniu szczurom20. Z drugiej strony leki aktywujące kanały CLC-KB mogą zwiększać resztkową aktywność wadliwych kanałów u pacjentów z typem III choroby Barttera.

CLC-7

Z podklasy transporterów wymiany 2Cl-/H+ CLC-7 jest obiecującym celem działania farmakologicznego, a jego inhibicja może być korzystna w osteoporozie. Po raz kolejny wskazanie to wywodzi się z obserwacji choroby u ludzi spowodowanej mutacjami typu loss-of-function w CLC-7, które powodują osteropetrozę21. W tym zaburzeniu dochodzi do upośledzenia przebudowy kości przez osteoklasty, co jak się uważa, jest spowodowane wadliwym wydzielaniem kwasów i enzymów. Prowadzi to do gęstej kości, która, jeśli zostanie odtworzona przez inhibitor CLC-7, może zmniejszyć rozpuszczanie kości, a tym samym wzmocnić szkielet pacjentów z osteoporozą22,23. W badaniach typu proof-of-concept farmakologiczne hamowanie zakwaszania24 lub zaburzenie funkcji CLC-7 przez przeciwciała25 zmniejszyło resorpcję kości. Jednak hamowanie CLC-7 może nie być pozbawione komplikacji, ponieważ badania na ludziach i myszach sugerują, że brak funkcji CLC-7 może być również związany z zaburzeniami przechowywania i degeneracji neuronów z powodu zmniejszonej funkcji lizosomalnej26.

Loss-of-function human mutations – lessons from CFTR

Warto w tym miejscu zrobić krótką przerwę, aby rozważyć, że niektóre wskazania terapeutyczne dla nowych leków ukierunkowanych na CLC mają na celu leczenie zaburzeń odmiennych i znajdujących się na przeciwnym końcu spektrum niż te, które są spowodowane wadliwą funkcją CLC. Oprócz tych opisanych powyżej, choroba Denta I jest chorobą nerek sprzężoną z chromosomem X, która jest spowodowana utratą funkcji CLC-5 (patrz27 w celu uzyskania najnowszego przeglądu). Wszystkie są rzadkimi dziedziczonymi zaburzeniami, a główny defekt białka obejmuje albo zmniejszoną aktywność białka, albo trafficking do błony docelowej. W rzeczywistości, wiele pojedynczych mutacji powoduje zatrzymanie ER i brak dojrzewania białka. Podobnie jest z mukowiscydozą, gdzie większość chorych posiada mutację ΔF508 powodującą zatrzymanie ER. Najnowsze i zróżnicowane podejścia do leczenia mukowiscydozy są wynikiem dwutorowego ataku mającego na celu korekcję składania zmutowanych białek (korektory CF) i/lub zwiększenie aktywności kanałów chlorkowych CFTR w błonie plazmatycznej (potencjatory CF). Sukcesy odnoszą leki z klasy potencjatorów28, które są skuteczne u pacjentów z mutacjami zmniejszającymi aktywność CFTR bez utraty biosyntezy lub handlu białkami (np. G551D), jednak skuteczność korektorów fałdowania (która jest wymagana w większości przypadków) pozostaje do ustalenia29. Chociaż wszystkie choroby związane z utratą funkcji CLC są rzadkimi zaburzeniami genetycznymi, być może pewnego dnia będziemy mogli leczyć osoby z miotonią, zespołem Barttera, chorobą Denta i osteopetrozą, a także mukowiscydozą za pomocą leków korygujących rzeczywistą przyczynę ich zaburzeń.

Kanały chlorkowe aktywowane wapniem

Na koniec wspomnę o kanałach chlorkowych aktywowanych wapniem (ClCa), które mają jasno zdefiniowane role fizjologiczne w wielu typach komórek, ale ich molekularna identyfikacja cierpiała z powodu kilku fałszywych i zacinających się początków. Historia dotyczy czterech typów białek: członków rodzin genów CLCA, Bestrophin, Tweety i TMEM16. We wszystkich przypadkach, ich rekombinowana nadekspresja skutkuje generowaniem błonowych prądów chlorkowych, które są stymulowane przez podniesienie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i, w różnym stopniu, depolaryzację błony. Podróż dla CLCA dobiegła końca, gdy okazało się, że jest to białko, które jest wydzielane, ale także prawdopodobnie zwiększa ekspresję błonowych kanałów ClCa endogennych dla systemu ekspresji30. Białka Tweety i Bestrophin nie wykazują wszystkich właściwości kanałów ClCa badanych w głównych tkankach, chociaż Best1 wydaje się być odpowiedzialny za komponent ClCa w neuronach czuciowych31 i może być również ważnym regulatorem uwalniania wapnia z retikulum endoplazmatycznego32,33. Trzy niezależne badania zaproponowały TMEM16A (zwany także Ano1) jako kandydata na główny składnik, jeśli nie w całości, aktywowanego wapniem kanału chlorkowego34-36. Wiele późniejszych badań, ułatwionych przez wytworzenie narzędzi molekularnych, potwierdziło tę tezę. TMEM16A jest ważny dla regulacji pobudliwości błony w mięśniach gładkich naczyń, jest wyregulowany w zwierzęcym modelu nadciśnienia płucnego, a ton może być zmniejszony przez inhibicję kanału37,38. W neuronach czuciowych TMEM16A sprzęga obecność mediatorów zapalnych z nadpobudliwością błony, a inhibicja TMEM16A ma działanie antynocyceptywne39. W zwierzęcych modelach astmy ekspresja tego szczególnego kanału chlorkowego jest zwiększona, a jego inhibicja może mieć korzystne działanie40. Występuje on również w komórkach śródmiąższowych Cajala jelita, a funkcja kanału jest wymagana do rytmicznego skurczu mięśni gładkich ściany jelita41. Ponadto, aktywacja TMEM16A może stanowić alternatywną ścieżkę dla nabłonkowego wydzielania chlorków w mukowiscydozie42. Podczas gdy nadal trwają dyskusje na temat dokładnej funkcji pozostałych członków rodziny TMEM16, funkcja ClCa została również przypisana TMEM16B (Ano2), który, jak się uważa, leży u podstaw kanału ClCa w węchowych komórkach włosowatych43,44. Mogą również istnieć role dla tej klasy kanału jonowego w biologii komórek nowotworowych, a jego inhibicja może zapobiegać proliferacji komórek45-48.

Uwagi końcowe

W niniejszym przeglądzie podkreślono różnorodne role białek przewodzących lub transportujących chlorki oraz to, jak ich dysfunkcja jest sprzężona z zaburzeniami u ludzi lub objawami chorobopodobnymi w modelach zwierzęcych. Istnieje poważny brak odczynników farmakologicznych, które hamują, aktywują lub poprawiają handel błonowy kanałów chlorkowych i transporterów. Czynione są postępy w zakresie leków odwracających wadliwą funkcję CFTR w mukowiscydozie, co, miejmy nadzieję, zaowocuje lekami specyficznymi dla różnych typów dziedziczonej mutacji. Inhibitory i aktywatory kanałów chlorkowych aktywowanych wapniem TMEM16A42,49 okazują się użytecznymi narzędziami laboratoryjnymi, a nowe związki mogą stać się skutecznymi lekami, szczególnie jeśli będą w stanie zapewnić działanie specyficzne dla danej tkanki. Cząsteczki specyficzne dla poszczególnych CLCs są prawdopodobnie najbardziej nieuchwytne. Zrozumienie strukturalnych podstaw aktywacji CLC typu bramkowanego napięciem50 może pozwolić na zidentyfikowanie domen białkowych, które mogą być celem racjonalnego projektowania leków opartego na strukturze. Takie narzędzia pozwolą nam przetestować niektóre z nowatorskich pomysłów terapeutycznych, które zostały tutaj przedstawione.

Biografia autora

Dr Jon Lippiat ukończył studia doktoranckie nad strukturą, funkcją i farmakologią kanałów potasowych na Uniwersytecie w Leicester. Zanim został powołany na stanowisko wykładowcy farmakologii na Uniwersytecie w Leeds, studiował funkcję komórek beta trzustki i cukrzycę na Uniwersytecie w Oxfordzie. Jego badania obejmują wyjaśnienie strukturalnych i fizjologicznych właściwości kilku różnych typów kanałów jonowych i transporterów oraz ich potencjalne ukierunkowanie za pomocą nowych odczynników farmakologicznych.