Mapping the Role of MAP7 in Axon Collateral Branching

Neurony mają zróżnicowaną i charakterystyczną morfologię dendrytów i aksonów. Prawidłowy rozwój tych struktur jest niezbędny dla prawidłowej funkcji i łączności. Rzeczywiście, nieprawidłowa morfologia neuronów została powiązana z różnymi zaburzeniami neurobiologicznymi i psychiatrycznymi (Luo i O’Leary, 2005). Rozwój różnych morfologii aksonów zależy od zdolności rosnących aksonów do reagowania na zewnątrzkomórkowe wskazówki. Te wskazówki indukują zlokalizowaną przebudowę cytoszkieletu dla skrętu aksonów i rozgałęziania (Armijo-Weingart i Gallo, 2017).

Rozwój aksonów w neuronach czuciowych DRG jest wysoce stereotypowy i dlatego stanowi dobry model do zrozumienia mechanizmu rozgałęziania aksonów. Te aksony czuciowe rozwidlają się po wejściu do rdzenia kręgowego, a aksony potomne rozchodzą się albo do przodu, albo do tyłu. Przednio rosnący akson będzie wznosił się w górę, aby przekazywać informacje sensoryczne przeznaczone do mózgu. Dodatkowo, wstępujące i zstępujące gałęzie aksonu będą generować śródmiąższowe kolaterale aksonalne, które tworzą się z ustalonego wału aksonalnego, aby unerwić różne blaszki wzdłuż osi grzbietowo-wewnętrznej w rdzeniu kręgowym (Gibson i Ma, 2011).

Późniejsza praca Tymanskyj i wsp. (2017) próbowali zidentyfikować białka, które pośredniczą w rozgałęzieniach aksonalnych w neuronach czuciowych DRG. Aby to zrobić, porównali profile transkrypcyjne neuronów DRG przed i po uformowaniu się gałęzi bocznych. Ponieważ białko związane z mikrotubulami 7 (MAP7) było silnie wyregulowane po utworzeniu się rozgałęzień, autorzy zbadali wpływ nadekspresji i knockdownu MAP7 na kultury pierwotnych neuronów czuciowych zebranych we wczesnych i późnych stadiach embrionalnych. Nadekspresja MAP7 zwiększyła liczbę rozgałęzień śródmiąższowych w młodszych neuronach, które nie wykazują typowej ekspresji MAP7. I odwrotnie, knock down MAP7 w starszych neuronach hodowanych po utworzeniu rozgałęzień in vivo skutkował mniejszą liczbą rozgałęzień śródmiąższowych in vitro. Eksperymenty te wykazały, że MAP7 jest zarówno wystarczający, jak i niezbędny do powstawania rozgałęzień śródmiąższowych w neuronach czuciowych.

Tymanskyj i wsp. (2017) rozumowali, że regulator powstawania rozgałęzień prawdopodobnie lokalizowałby się do regionów aksonu, w których powstają rozgałęzienia. Rzeczywiście, autorzy znaleźli silną preferencję dla MAP7 w punktach rozgałęzień. Ponieważ rodzące się rozgałęzienia powstają z filopodiów, które są stabilizowane przez penetrację mikrotubul, czas lokalizacji MAP7 w punktach rozgałęzień mógłby wskazywać na jej rolę w regulowaniu czasu i wzoru formowania się rozgałęzień. Autorzy przeprowadzili więc obrazowanie na żywo i stwierdzili, że znakowany fluorescencyjnie MAP7 był nieobecny w pionierskich filopodiach, ale miał opóźnione wejście do nowych rozgałęzień wzbogaconych w mikrotubule. Dalsze prace wykazały, że MAP7 preferencyjnie lokalizował się w długich i stabilnych gałęziach. Łącznie, badania te wskazują, że MAP7 jest krytyczny dla dojrzewania gałęzi, ale prawdopodobnie nie dla początkowego tworzenia gałęzi.

Ale chociaż te manipulacje in vitro ustaliły rolę MAP7 w bocznym rozgałęzieniu, autorzy starali się to potwierdzić używając mysiego mutanta, w którym białko MAP7 jest obcięte na końcu C (MAP7mshi) (Turner i in., 1997). Wcześniej wykazano, że terminus C MAP7 oddziałuje z kinezyną (Sung i in., 2008; Barlan i in., 2013). Tymanskyj i wsp. (2017) rozumowali więc, że jest to mechanizm rozgałęziania się aksonów i neurony MAP7mshi będą miały mniej kolaterali. Co zaskakujące, neurony czuciowe hodowane od myszy MAP7mshi miały drastyczny wzrost rozgałęzień aksonów w porównaniu z neuronami od zwierząt kontrolnych. To, w połączeniu z wcześniejszymi wynikami in vitro, silnie sugeruje, że N-końcówka, a nie C-końcówka MAP7 jest kluczowa dla promowania rozgałęziania się aksonów. Co intrygujące, gdyby terminus C był zbędny do promowania rozgałęziania, wtedy rozsądnie byłoby założyć, że neurony MAP7mshi byłyby podobne do neuronów kontrolnych; jednakże, zamiast tego, utrata terminusa C MAP7 powoduje nasilenie rozgałęziania bocznego. Jednym z wyjaśnień jest to, że domena C-końcowa blokuje funkcję N-końcową, a utrata C-końca prowadzi do wybujałego rozgałęziania. Możliwe jest również, że obcięcie C-końca powoduje nienormalnie wysoki poziom białka MAP7 u zmutowanych myszy, promując rozgałęzianie się aksonów, podobnie jak nadekspresja MAP7 in vitro. Chociaż Tymanskyj i wsp. (2017) wykorzystali analizę in situ i RT-PCR, aby potwierdzić obecność obciętego mRNA u zwierząt MAP7mshi, porównywalne poziomy ekspresji MAP7 są niejasne. Dlatego dokładna rola regulacyjna terminusa C będzie wymagała dalszych badań.

Kluczowe odkrycie z MAP7mshi zwierząt pochodzi z analizy projekcji neuronów czuciowych DRG. Neurony czuciowe muszą prawidłowo unerwiać zarówno obwodowe tkanki docelowe, takie jak skóra i mięśnie, jak i rdzeń kręgowy poprzez tworzenie szeregu kolaterali aksonalnych w obu regionach, aby uzyskać dokładną wrażliwość na bodźce zewnętrzne. Co ciekawe, myszy MAP7mshi wykazywały zwiększoną liczbę kolaterali aksonów rozgałęziających się do rdzenia kręgowego w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, podczas gdy liczba kolaterali w przedniej łapie była normalna. Nieprawidłowe unerwienie aksonów DRG w rdzeniu kręgowym u myszy MAP7mshi było związane z hiperalgezją termiczną, co sugeruje, że nocyceptory DRG zależą od MAP7 dla prawidłowego formowania aksonów. Czy inne podtypy neuronów DRG wymagają MAP7 wymaga dalszych badań. Chociaż Tymanskyj i wsp. (2017) hodowali heterogenną populację neuronów czuciowych z dysocjowanych DRG, suplementowali te kultury czynnikiem wzrostu nerwów (NGF), który dostarcza czynnika troficznego tylko dla podzbioru podtypów neuronów (tj. nocyceptorów) (Lallemend i Ernfors, 2012). Inne podtypy neuronów DRG (np. proprioceptory) nie otrzymują wsparcia troficznego od NGF i dlatego zostały wykluczone z tych hodowli (Lallemend i Ernfors, 2012). To, czy zarówno nocyceptory jak i proprioceptory polegają na MAP7 jest szczególnie interesujące, ponieważ rzutują one do różnych celów. Co jednak istotne, Tymanskyj i wsp. (2017) stwierdzili, że (1) tylko podzbiór rozgałęzień wyłaniał się z regionu wzbogaconego w MAP7, (2) tylko podzbiór regionów wzbogaconych w MAP7 wzdłuż aksonu wytwarzał rozgałęzienia i (3) myszy MAP7mshi miały nieprawidłowości rozgałęzień w projekcjach centralnych, ale nie obwodowych. Tak więc, jest prawdopodobne, że inne czynniki rządzą tworzeniem rozgałęzień w tych aksonach.

Duża praca wykazała, że wskazówki środowiskowe kształtują formowanie rozgałęzień aksonu poprzez wyzwalanie wysoce regulowanej sekwencji zdarzeń cytoszkieletowych, w tym tworzenie łaty aktynowej, pojawianie się filopodiów oraz polimeryzację i depolimeryzację mikrotubul (Armijo-Weingart i Gallo, 2017). Białka związane z mikrotubulami (MAPs) mogą pośredniczyć w zmianach cytoszkieletu poprzez pozytywny lub negatywny wpływ na stabilność i wiązanie mikrotubul (Armijo-Weingart i Gallo, 2017). Podobna do nowatorskiej roli MAP7 w dojrzewaniu gałęzi czuciowych, wcześniejsze prace zidentyfikowały rolę MAP7 w stabilności mikrotubul komórek Sertoliego i spermatogenezie, gdzie brak MAP7 u myszy prowadzi do męskiej bezpłodności (Komada i in., 2000; Magnan i in., 2009). I odwrotnie, Tymanskyj i inni (Tymanskyj i wsp., 2012; Barnat i wsp., 2016) zidentyfikowali MAP1B jako negatywny regulator rozgałęziania i dojrzewania aksonów w korowych i dorosłych neuronach DRG. Prace te rzucają światło na zróżnicowany zestaw narzędzi białkowych dostępnych dla wewnętrznych programów dojrzewania rozgałęzień. Intrygującym pytaniem jest, co kontroluje konkurencję pomiędzy pozytywnymi i negatywnymi regulatorami w pośredniczeniu w budowie lub niszczeniu gałęzi.

Lokalnie posegregowane gałęzie z pojedynczego neuronu mogą odpowiadać na permisywne i/lub restrykcyjne wskazówki. Jak wspomniano powyżej, Tymanskyj i wsp. (2017) stwierdzają, że myszy MAP7mshi mają aberrant collateral branching w rdzeniu kręgowym, ale nie w przedniej łapie, co sugeruje, że te rozbieżne gałęzie odpowiadają na różne wskazówki środowiskowe. To widoczne ograniczenie funkcji MAP7 do centralnego, ale nie obwodowego, rozgałęziania bocznego odzwierciedla jednostronną funkcję kinaz SAD w centralnym, ale nie obwodowym, unerwieniu w neuronach proprioceptywnych, innym podtypie neuronów czuciowych (Lilley i in., 2013). Lilley i wsp. (2013) proponują model, w którym kinazy SAD rzeźbią łuki aksonalne poprzez sekwencyjną długo- i krótkoterminową ekspozycję na neurotrofiny. Neurony proprioceptywne otrzymują toniczną, długotrwałą ekspozycję na neurotrofinę-3 z celów peryferyjnych, takich jak mięśnie, co powoduje wzrost ekspresji kinazy SAD. Ta regulacja przygotowuje aksony do wewnętrznego programowania rozgałęzień, ale ten szlak jest uruchamiany tylko po krótkotrwałej ekspozycji na neurotrofinę-3 z neuronów docelowych w rdzeniu kręgowym, takich jak neurony ruchowe, w celu wywołania obfitych rozgałęzień w brzusznej części rdzenia kręgowego (Lilley i in., 2013). W przeciwieństwie do tego, patterning aksonów w innych podtypach neuronów może być regulowany przez różne wskazówki zewnątrzkomórkowe. Na przykład współczulny układ nerwowy, inna populacja zależna od neurotrofin, odpowiada na dwie różne wskazówki neurotroficzne na kolejnych etapach projekcji aksonalnej. Aksony współczulne początkowo rosną wzdłuż naczyń krwionośnych, będących celem pośrednim, które wydzielają neurotrofinę promującą wydłużanie aksonów (Kuruvilla i in., 2004). Jednakże, po końcowym unerwieniu, zakończenia aksonów są wystawione na działanie NGF, który jest produkowany przez tkankę docelową. NGF pochodzący z tkanki docelowej indukuje przełącznik sygnalizacyjny, który zatrzymuje wzrost aksonów i zachęca do rozgałęziania się, aby umożliwić rozległe unerwienie tkanki docelowej (Suo i in., 2015). Być może zależne od MAP7 dojrzewanie rozgałęzień również opiera się albo na (1) pojedynczej wskazówce patterningu aksonów z czasowo i lokalnie odrębnymi wzorcami, albo (2) różnych sekwencyjnych wskazówkach z pośrednich i końcowych celów.

Zaburzenia neurologiczne mogą być związane ze zmienionym zachowaniem aksonów i łącznością mózgu, przyczyniając się do ich złożonej i wieloczynnikowej natury. Intrygująco, MAP7 ulega ekspresji w mózgach embrionalnych myszy, a dokładne badania mapowania genetycznego wykazują znaczące powiązanie w polimorfizmach pojedynczego nukleotydu MAP7 ze schizofrenią (Fabre-Jonca i in., 1998; Torri i in., 2010; Venkatasubramanian, 2015). Po odkryciach Tymanskyj i wsp. (2017) w obwodowym układzie nerwowym, krytyczne będzie zbadanie regulacji MAP7 dojrzewania gałęzi aksonalnych w mózgu, aby wyjaśnić wszelkie powiązania między MAP7 a schizofrenią. Dodatkowo, poza rozwojem obwodowego układu nerwowego, boczne rozgałęzianie aksonów jest wymagane w całym układzie nerwowym i jest krytyczne dla prawidłowego okablowania. Poprzednie badania wskazują, że aktywacja wewnętrznych programów komórkowych, które promują polimeryzację mikrotubul, może pozytywnie regulować odrastanie aksonów i rozgałęzianie po urazie (Ruschel et al., 2015). Dlatego, aby odkryć potencjalne cele terapeutyczne dla odrastania aksonów, przyszłe badania mogą skupić się na MAP7, aby ponownie zaangażować wewnętrzne programowanie rozwojowe.

.