Rajskub pierwszą rolę była jako Oompa-Loompa w produkcji teatru społecznościowego Willy Wonka & the Chocolate Factory, a jej pierwszą główną rolą była Raggedy Ann. W 1996 roku wystąpiła w teledyskach do piosenek „The Good Life” zespołu Weezer i „The New Pollution” Becka.
W latach 1996-1998 miała powracającą rolę w serialu HBO Larry Sanders Show jako asystentka rezerwacji Mary Lou Collins.
Jej najbardziej znaną rolą jest analityk systemów CTU Chloe O’Brian w serialu 24, do którego dołączyła w 2003 roku na początku trzeciego sezonu serialu. Jej postać okazała się hitem wśród widzów i krytyków i była jednym z niewielu członków obsady, którzy powrócili w czwartym sezonie serialu. Po tym, jak przez dwa sezony regularnie pojawiała się w serialu, w piątym sezonie stała się główną postacią obsady. Do końca serii była główną kobietą, z główną rolą na drugim miejscu po Kieferze Sutherlandzie. Jej postać miała również zaszczyt wypowiedzieć ostatnie słowa serii w finale 8 sezonu. Rajskub i Sutherland pojawili się krótko jako ich 24 postacie w odcinku z 2007 roku, „24 Minutes”, serialu animowanego Fox The Simpsons. W sierpniu 2013 roku ogłoszono, że będzie ona reprise jej Chloe O’Brian rolę w 2014 ograniczonej serii 24: Live Another Day.
Rajskub był jednym z oryginalnych członków obsady Pan Show. Pojawiła się w Kelsey Grammer’s The Sketch Show na Fox Television, The King of Queens jako postać o imieniu Priscilla, a także w licznych filmach, w tym Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, teledyskach dla Becka, Weezera i Sheryl Crow, a także portretując niewidomą kobietę w filmie Road Trip.
Rajskub była częścią duetu komiksowego (z Karen Kilgariff) o nazwie Girls Guitar Club. W 2006 roku pojawiła się w „Partings”, finale szóstego sezonu Gilmore Girls, gdzie zagrała trobairitz szukającą swojego wielkiego przełomu. (Rajskub pojawiła się wcześniej w Gilmore Girls jako główna bohaterka w A Film by Kirk, krótkim filmie nakręconym przez postać Kirka Gleasona). Jako aktorka była wolontariuszką w programie Young Storytellers. Ma wykształcenie malarskie, uczęszczała do San Francisco Art Institute.
Rajskub była dwukrotnie nominowana do nagrody Screen Actors Guild Award; raz w 2005 roku, i ponownie w 2007 roku za Outstanding Performance by an Ensemble in a Drama Series. Wystąpiła gościnnie w odcinku Flight of the Conchords „Prime Minister” jako Karen, fanatyczka Arta Garfunkela. Gościnnie wystąpiła jako „Gail the Snail” w odcinku It’s Always Sunny in Philadelphia zatytułowanym „The Gang Gives Frank an Intervention”, a następnie powtórzyła tę rolę w finale dziewiątego sezonu „The Gang Squashes Their Beefs” oraz w trzynastym sezonie „The Gang Beats Boggs: Ladies Reboot.” W 2009 roku wystąpiła również w filmie Julie & Julia jako Sarah, jedna z bliskich przyjaciółek Julie Powell. W 2010 roku Rajskub wystąpiła w stand-upie w programie Johna Olivera „New York Stand Up Show”. W czerwcu 2010 roku pojawiła się w odcinku „Lovesick” podczas drugiego sezonu serialu USA Royal Pains.
Od lipca do października 2010 roku występowała w swoim solowym show, Mary Lynn Spreads Her Legs, w Steve Allen Theater w Los Angeles. Recenzentka F. Kathleen Foley z Los Angeles Times napisała, że „ten radośnie wulgarny tytuł podsumowuje ogólny ton, który często jest lekko obsceniczny”. Pokaz, napisany przez Rajskub z pomocą reżysera / dewelopera Amit Itelman, został zainspirowany doświadczeniami Rajskub z ciąży, porodu i wczesnego macierzyństwa.
W styczniu 2011 roku, Rajskub gościnnie wystąpił w odcinku „Nasze dzieci, Ourselves” na drugim sezonie ABC’s Modern Family. Jesienią 2011 roku, Rajskub pojawiła się w krótkim sitcomie Jak zostać dżentelmenem. Również w 2011 roku, serial internetowy Rajskub, Dicki, rozpoczął emisję na My Damn Channel. Dicki jest oparta na osobach, które dorastały w Michigan i okolicach. Tytułowa bohaterka to 40-letnia kobieta, która mieszka w domu z rodzicami, zajmuje się rękodziełem i poważnie traktuje swoją sztukę. Dicki jest jak dotąd jednym z najbardziej udanych seriali internetowych My Damn Channel. Pierwszy sezon zakończył się w listopadzie 2011 roku, ale drugi sezon jest obecnie w fazie rozwoju. Rajskub wystąpiła w czerwcu 2012 roku w Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), comiesięcznym showcase, w którym gwiazdy dzielą się prawdziwymi historiami, których nie chciałyby, aby ich matki poznały. Obecnie prowadzi podcast w sieci Nerdist o nazwie Kickin’ it Mary Lynn Style.
W 2013 roku Rajskub pojawiła się w czwartym sezonie Arrested Development w cichej, ale dobrze przyjętej roli jako Heartfire, postać, o której Rajskub powiedziała, że „mówi z serca, ale nie używa żadnych słów”. W tym samym roku Rajskub pojawiła się również w serialu internetowym All Growz Up z Melindą Hill.
Rajskub pojawiła się na podcaście Ken Reid’s TV Guidance Counselor 27 marca 2015 roku.
W sierpniu 2016 roku Rajskub pojawiła się na Edinburgh Festival Fringe w 24 Hours With Mary Lynn Rajskub i została dobrze przyjęta przez fanów i krytyków.
W 2017 roku Rajskub pojawiła się w pierwszym sezonie serialu Adult Swim Dream Corp LLC, grając pacjenta 46 w odcinku „Are You Down With OCD?”.
W 2018 roku Rajskub pojawiła się w Night School naprzeciwko Kevina Harta, Tiffany Haddish, Roba Riggle’a, Tarana Killama, Megalyn Echikunwoke, Ala Madrigala, Anne Winters, Fat Joe i Keitha Davida.
W 2021 roku Rajskub wydała 49-minutowy specjalny komediowy zatytułowany Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; można go wypożyczyć lub kupić za pośrednictwem kilku usług wideo na żądanie.
.