Metylotransferazy DNA (MTazy), które przenoszą grupę metylową z S-adenozylometioniny na reszty adeninowe lub cytozynowe, występują u wielu prokariotów i eukariotów. Metylacja powinna być brana pod uwagę podczas trawienia DNA endonukleazami restrykcyjnymi, ponieważ rozszczepienie może być zablokowane lub upośledzone, gdy określona zasada w miejscu rozpoznania jest zmetylowana.
Metylacja u prokariotów
U prokariotów MTazy są najczęściej identyfikowane jako elementy systemów restrykcyjnych/modyfikacyjnych, które działają w celu ochrony DNA gospodarza przed rozszczepieniem przez odpowiednią endonukleazę restrykcyjną. Większość laboratoryjnych szczepów E. coli zawiera trzy specyficzne dla danego miejsca metylazy DNA.
- Metylaza Dam – metylacja w pozycji N6 adeniny w sekwencji GATC (1,2).
- Metylotransferazy Dcm – metylacja w pozycji C5 drugiej cytozyny w sekwencjach CCAGG i CCTGG (1,3).
- EcoKI metylaza-metylacja adeniny w sekwencjach AAC(N6)GTGC i GCAC(N6)GTT.
Niektóre lub wszystkie miejsca dla endonukleazy restrykcyjnej mogą być oporne na rozszczepienie, gdy są izolowane ze szczepów wyrażających metylazy Dam lub Dcm, jeżeli miejsce rozpoznania metylazy pokrywa się z miejscem rozpoznania endonukleazy. Na przykład, plazmidowe DNA wyizolowane z Dam+ E. coli jest całkowicie odporne na rozszczepienie przez MboI, która rozszczepia w miejscach GATC.
Nie wszystkie DNA wyizolowane z E. coli jest metylowane w tym samym stopniu. Podczas gdy DNA pBR322 jest w pełni zmodyfikowane (i dlatego całkowicie odporne na trawienie przez MboI), tylko około 50% miejsc λ DNA Dam jest zmetylowane, przypuszczalnie dlatego, że metylaza nie ma możliwości pełnej metylacji DNA zanim zostanie ono zapakowane do główki faga. W rezultacie, enzymy zablokowane przez modyfikację Dam lub Dcm dadzą częściowe wzory trawienia z λ DNA.
Miejsca ograniczeń, które są zablokowane przez metylację Dam lub Dcm mogą być niemetylowane przez klonowanie DNA do szczepu Dam-, dcm- E. coli, takiego jak Dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925).
Miejsca ograniczeń mogą być również zablokowane, jeżeli obecne jest nakładające się miejsce. W tym przypadku część sekwencji Dam lub Dcm jest generowana przez sekwencję enzymu restrykcyjnego, a następnie przez sekwencję flankującą. Sytuacja ta powinna być również brana pod uwagę przy projektowaniu enzymów restrykcyjnych.
Metylacja eukariotyczna
CpG MTazy, występujące u wyższych eukariotów (np. Dnmt1), przenoszą grupę metylową do pozycji C5 reszt cytozyny. Wzorce metylacji CpG są dziedziczne, specyficzne tkankowo i korelują z ekspresją genów. W związku z tym postuluje się, że metylacja CpG odgrywa rolę w różnicowaniu i ekspresji genów (4).
Uwaga: Efekty metylacji CpG są głównie problemem podczas trawienia eukariotycznego genomowego DNA. Wzorce metylacji CpG nie są zachowywane po sklonowaniu DNA do gospodarza bakteryjnego.
Wrażliwość na metylację
W poniższej tabeli podsumowano wrażliwość na metylację dla enzymów restrykcyjnych NEB, wskazując, czy rozszczepienie jest blokowane lub upośledzane przez metylację Dam, Dcm lub CpG, jeśli lub gdy zachodzi ona na każde miejsce rozpoznania. Tabela ta powinna być traktowana jako przewodnik po zachowaniu wymienionych enzymów, a nie jako bezwzględny wskaźnik. Skonsultuj się z REBASE , bazą danych enzymów restrykcyjnych, aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje i konkretne przykłady, na których oparte są te wytyczne.
- Marinus, M.G. and Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. and Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. and Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legenda
| ● | Nieczułe | ◆ | Nieczułe. |
| ◼ | Blokada | ◇ ol | Impaired by Overlapping |
| ◻ ol | Blocked by Overlapping | ◇ scol | Impaired by Some Combinations of Overlapping |
| ◻ scol | Blocked by Some Combinations of Overlapping | ||
Kod jednoliterowy