W naszym badaniu, retrospektywnie wykryliśmy obecność mutacji CALR w kohorcie 524 pacjentów JAK2 V617F-ujemnych, u których wystąpiło kliniczne i/lub laboratoryjne podejrzenie MPN, a głównym celem było określenie wartości diagnostycznej tej detekcji. W obserwowanym okresie mutacje CALR nie były rutynowo badane u pacjentów z podejrzeniem MPN w naszym ośrodku, ponieważ zostały odkryte dopiero niedawno1,2. W przeciwieństwie do tego, mutacja JAK2 V617F jest już rutynowo analizowana od czasu jej odkrycia w 2005 roku20. Z tego powodu pacjenci JAK2 V617F-dodatni zostali wykluczeni z badania. Mutacja MPL jest stosunkowo rzadkim znaleziskiem u pacjentów z MPN i jest najczęściej obecna u pacjentów z ET lub PMF21. W naszym laboratorium badanie MPL zostało włączone do algorytmu diagnostycznego u pacjentów z podejrzeniem MPN dopiero niedawno i jest wykonywane dopiero po wykluczeniu mutacji JAK2 V617F i CALR. Dlatego też status MPL nie został określony u wszystkich naszych pacjentów w czasie pierwszego badania.
Nasz ośrodek jest uniwersyteckim szpitalem medycznym obsługującym obszar zamieszkały przez około 1 000 000 mieszkańców i jest ośrodkiem referencyjnym dla hematologicznych nowotworów złośliwych. Wszyscy pacjenci kierowani do oddziału hematologii byli najpierw oceniani przez lekarzy ogólnych bez szczegółowej wiedzy z zakresu hematologicznych nowotworów złośliwych. Jak przedstawiono w tabeli 3, tylko u części chorych kierowanych do Kliniki Hematologii w chwili pierwszego badania stwierdzono patologiczne parametry kliniczne i/lub laboratoryjne podejrzane o MPN. W związku z tym większość pacjentów kierowanych do Kliniki Hematologii stanowiły osoby bez nowotworu hematologicznego, gdyż jak ustaliliśmy, 380 pacjentów (380/524 = 72,5%) było wolnych od MPN. U chorych tych rozpoznano wtórne zmiany w obrazie krwi obwodowej spowodowane różnymi schorzeniami, takimi jak: niedobór żelaza, choroby zakaźne i zapalne, hiposplenizm, nowotwory złośliwe, palenie tytoniu, przebyte zabiegi operacyjne, stosowanie kortykosteroidów i przewlekłe niedotlenienie. W związku z tym liczba pacjentów CALR-pozytywnych w naszej kohorcie była niska. Zidentyfikowaliśmy 4,4% pacjentów podejrzanych o MPN jako CALR dodatnich, z których większość została zdiagnozowana jako ET lub PMF. W większości podobnych badań analizowano liczbę CALR-dodatnich pacjentów z potwierdzonym MPN; dlatego liczba CALR-dodatnich pacjentów była znacznie wyższa, wahając się od 12 do ponad 20%22,23,24,25,26. W oparciu o nasze dane korzystne byłoby ulepszenie podejścia diagnostycznego do pacjentów z podwyższonym poziomem jednej lub więcej linii komórkowych krwi, ponieważ w większości przypadków nie jest to spowodowane hematologicznym nowotworem złośliwym. Pacjenci powinni być rutynowo badani w kierunku najczęstszych przyczyn wtórnej erytrocytozy, trombocytozy i leukocytozy, a morfologia krwi powinna być powtarzana co najmniej raz na wizytach kontrolnych przed skierowaniem do Kliniki Hematologii. Molekularne badania genetyczne powinny być zarezerwowane dla pacjentów z dużym podejrzeniem klonalnej choroby hematologicznej i nie powinny być wykonywane u wszystkich pacjentów kierowanych do Kliniki Hematologii.
Mutacje CALR są powszechnie identyfikowane u JAK2 V617F-ujemnych pacjentów z ET1,2. W naszym ośrodku tylko u mniejszości pacjentów CALR-dodatnich (7/23 = 30%) rozpoznano ET zgodnie z kryteriami WHO z 2008 roku w czasie pierwszego badania. Głównym tego powodem była względna rezerwa wobec badania szpiku kostnego u pacjentów z umiarkowaną trombocytozą i niskim ryzykiem powikłań zakrzepowych. Oznacza to jednak, że mogliśmy niedoszacować liczby pacjentów z trombocytozą klonalną. Potwierdzając obecność mutacji CALR, byliśmy w stanie retrospektywnie zdiagnozować 9 pacjentów z ET zgodnie ze zmodyfikowanymi kryteriami WHO dla ET13. Chociaż wszyscy ci pacjenci byli obserwowani w naszym oddziale z powodu wysokiego podejrzenia trombocytozy klonalnej, możliwość potwierdzenia rozpoznania ET za pomocą nieinwazyjnej procedury, jaką są badania molekularno-genetyczne, przynosi ogromne korzyści prognostyczne i terapeutyczne. Mutacje CALR są zatem ważnym wyróżnikiem diagnostycznym ET, co zostało również potwierdzone ostatnio w literaturze27,28.
Wszyscy pacjenci z PMF zostali zdiagnozowani zgodnie z kryteriami WHO w momencie badania w Klinice Hematologii. Identyfikacja mutacji CALR retrospektywnie potwierdzała rozpoznanie, ale nie miała bezpośredniego wpływu diagnostycznego ani terapeutycznego.
CMML jest podtypem MDSs/MPNs, a nie stricte MPNs12. Mutacje CALR u chorych na CMML są niezwykle rzadkie i nie odgrywają istotnej roli w jej patogenezie. W badaniu grupowym przeprowadzonym przez Zamorę i wsp. wykazano, że tylko u 1 ze 174 pacjentów z CMML stwierdzono mutację CALR29. Pacjentka z naszego badania, u której rozpoznano CMML typu pierwszego, a następnie nastąpiła progresja do mielofibrozy, mogła zostać błędnie zdiagnozowana podczas pierwszego badania, ponieważ PMF i CMML mają wiele wspólnych cech, w tym monocytozę i włóknienie szpiku kostnego. W niedawnym badaniu przeprowadzonym przez Hu i wsp. dokładniejsza analiza pozwoliła na przeklasyfikowanie wielu pacjentów, u których rozpoznano CMML, na PMF, co pokazuje, że w celu postawienia dokładnej diagnozy należy przeprowadzić bardziej dogłębną analizę, zwłaszcza u pacjentów z biomarkerami molekularnymi typowymi dla ET/PMF11,30.
Opisano ponad 50 mutacji CALR typu frameshift, a wszystkie są zlokalizowane w eksonie 9 genu CALR. Istnieją dwa główne typy mutacji CALR: typ 1 (delecja 52-bp; p.L367fs*46) i typ 2 (insercja 5-bp TTGTC; p.K385fs*47). Na podstawie charakterystyki molekularnej, inne mutacje mogą być pogrupowane jako typ 1-podobny i typ 2-podobny31. W naszym badaniu najczęstszym typem mutacji CALR był typ 1, co jest zgodne z danymi z piśmiennictwa2,16,32. Mutacje, które nie są ani typu 1, ani typu 2, powinny być klasyfikowane jako typ 1-podobny lub typ 2-podobny, ponieważ może to mieć wpływ na fenotyp kliniczny, a w przypadku PMF nawet na przeżycie17. Mutacje typu 1 i typu 2 w naszym badaniu zostały zdefiniowane przy użyciu AGADIR15, algorytmu aproksymacji statystycznej, który oblicza skłonność do tworzenia helis dla 31 unikalnych sekwencji aminokwasowych, które są zmieniane przez mutacje CALR16. Algorytm ten był stosowany w podobnych badaniach i stanowi ważne narzędzie w subklasyfikacji mutacji CALR16,17. Niezwykle ważne wydaje się właściwe określenie typu mutacji CALR, gdyż ma to również znaczenie diagnostyczne. Wiadomo, że tylko mutacje prowadzące do przesunięcia ramki odczytu o + 1 (-1 + 2) są patogenne6. Inne mutacje CALR mogą być wariantami germline CALR o nieznanym znaczeniu klinicznym. W naszym badaniu mutacje CALR typu non-frameshift wykryto u dwóch pacjentów. U jednego z nich w czasie badania w Klinice Hematologii rozpoznano trombocytozę reaktywną i retrospektywnie określono go jako CALR-dodatniego. Szczegółowa analiza potwierdziła mutację CALR typu missense, która skutkuje zastąpieniem kwasu glutaminowego kwasem asparaginowym w pozycji aminokwasowej 398. Taką samą mutację wykryto u pacjenta z definiowaną przez WHO przewlekłą białaczką neutrofilową (CNL) w badaniu Lasho i wsp. W jego pracy stwierdzono, że mutacje CALR, które nie prowadzą do wytworzenia odrębnego C-terminusu, sugerują inny mechanizm patogenetyczny, który może być jeszcze nieznany33. W naszym badaniu założyliśmy, że u naszego pacjenta nie wystąpiła mutacja CALR, która sugerowałaby klonalną chorobę hematologiczną. Na podstawie wywiadu, badania klinicznego i wyników badań laboratoryjnych u pacjenta sugerowano głównie trombocytozę reaktywną. W chwili pisania tego artykułu pacjent był w dobrym stanie zdrowia, bez żadnych możliwych powikłań związanych z klonalną chorobą hematologiczną.
U innego pacjenta z mutacją CALR non-frameshift rozpoznano MPN-U. Pacjent ten był nosicielem germinalnej delecji in-frame w genie CALR (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), która została już wcześniej rozpoznana u objawowego pacjenta z MPN34. Chociaż motyw KDEL został zachowany, delecja jednego aminokwasu (p.(Glu381del)) doprowadziła do zmiany struktury drugorzędowej białka, jak również struktury trójwymiarowej, co doprowadziło do wniosku o patogennym charakterze tej delecji in-frame23,34,35. Niestety, nasz pacjent z MPN-U został utracony w trakcie obserwacji, a dokładna diagnoza hematologiczna lub ewentualne powikłania nie mogły zostać określone. Jednak wyniki laboratoryjne sugerowały klonalną chorobę hematologiczną.
W naszym badaniu odkryliśmy cztery nowe mutacje CALR w eksonie 9, które, zgodnie z naszą wiedzą, nie zostały jeszcze zarejestrowane w bazie danych COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) lub HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk). Baza COSMIC jest największą na świecie bazą danych o mutacjach somatycznych w nowotworach człowieka, gromadzoną przez ekspertów. Opisuje ona ponad 4 miliony mutacji kodujących36. Baza HGMD stanowi próbę zestawienia wszystkich znanych (opublikowanych) zmian w genach odpowiedzialnych za choroby dziedziczne człowieka19. Nowe mutacje, które zostały zdefiniowane w naszym badaniu to NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTATC, p.(Lys385Ilefs*47) oraz NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Wszystkie te mutacje były mutacjami typu 2.
ET i PMF wiążą się ze zwiększonym ryzykiem zdarzeń zakrzepowych i zakrzepowo-zatorowych, które stanowią ważną przyczynę zachorowalności i śmiertelności37. Zmniejszenie ryzyka powikłań zakrzepowych i zakrzepowo-zatorowych jest jednym z najważniejszych celów leczenia, zwłaszcza u chorych z ET38. Chorzy ci są również narażeni na większe ryzyko powikłań krwotocznych, które mogą być związane z powikłaniami leczenia lub nabytym zespołem von Willebranda (AVWS) z powodu skrajnej trombocytozy (płytki krwi > 1000 × 109/L)28,39,40. Ryzyko wystąpienia zakrzepicy u chorych z ET przekracza 20%41. W badaniu szwedzkim u 35% chorych z ET wystąpiły powikłania naczyniowe42. W PMF zdarzenia zakrzepowe występują mniej więcej tak samo często jak w ET43. Częstość występowania powikłań zakrzepowych u chorych z PMF waha się od 7 do 30%44,45,46. W naszym badaniu częstość występowania powikłań zakrzepowych u pacjentów CALR-dodatnich wynosiła 30%. Jednak u trzech pacjentów powikłania zakrzepowe wystąpiły ponad 10 lat przed podejrzeniem MPN. Rzeczywista częstość występowania powikłań zakrzepowych w naszym badaniu była więc niższa. U jednego pacjenta wystąpił krwotok do ciała szklistego, który był wynikiem nieodpowiedniej terapii przeciwzakrzepowej warfaryną. Żaden z dwóch pacjentów z powikłaniem krwotocznym nie miał skrajnej trombocytozy w momencie wystąpienia powikłania. W porównaniu z mutacjami JAK2 V617F i MPL, CALR jest mutacją korzystną i wiąże się z mniejszą częstością występowania zdarzeń zakrzepowych1,2,47. U większości CALR-dodatnich pacjentów, u których wystąpiły powikłania zakrzepowo-zatorowe, rozpoznano mutacje typu 1 (71,4%). Jak już wykazano, pacjenci z mutacjami typu 1 mieli większe ryzyko zakrzepicy w porównaniu z pacjentami z mutacjami typu 210.
Mutacje CALR są obecnie znane jako jeden z trzech głównych typów mutacji, obok JAK2 V617F i mutacji MPL, u pacjentów z ET lub PMF. Nadal jednak 10-15% pacjentów z ET lub PMF ma nieznany molekularny marker genetyczny leżący u podłoża choroby. Pacjentów tych określa się mianem „potrójnie negatywnych „48. U tych chorych poszukiwano nowych biomarkerów molekularnych poprzez sekwencjonowanie eksonów kodujących w genach nowotworów szpiku, co przyniosło obiecujące wyniki. Może to zapewnić spersonalizowane podejście do diagnostyki u pacjentów z MPN49.
Mutacje CALR u pacjentów z MPN są również przedmiotem badań pod kątem ich potencjału terapeutycznego50,51,52. Mutacje eksonu 9 CALR mogą być celem dla immunoterapii nowotworów, ponieważ wykazano, że działają one jako immunogenne neoantygeny51. W leczeniu MPN korzystne mogłoby być połączenie szczepionek CALR z leczeniem immunomodulacyjnym53 , takim jak interferon alfa (IFN-α)54 lub ligand programowanej śmierci 1 (PD-L1)55 , jako kombinatoryczna szczepionka przeciwnowotworowa53. Mutacje CALR, poza tym, że są ważnymi markerami diagnostycznymi i prognostycznymi u pacjentów z MPN, mogą w przyszłości stać się ważnym celem terapeutycznym w podgrupie pacjentów z MPN.
.