Nie stwierdzono wzrostu fosforylacji CAP1, ale podwyższony poziom fosforylacji S308/S310, wykryto w komórkach raka trzustki
Poziomy białka CAP1 oznaczono metodą Western blotting w panelu powszechnie stosowanych linii komórkowych raka trzustki {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 i Mia PaCa-229} i porównano z poziomem w unieśmiertelnionej, ale nieprzekształconej linii komórkowej trzustki hTERT-HPNE30, która służy jako kontrola. Jak pokazano na Rys. 1A, wszystkie cztery nowotworowe linie komórkowe wykazują obfite poziomy CAP1, co jest porównywalne z poziomem w komórkach HeLa, o których wcześniej donosiliśmy, że wykazują obfite poziomy zarówno CAP1, jak i CAP212. Stwierdziliśmy, że nietransformowane komórki hTERT-HPNE wyrażają porównywalne poziomy CAP1 do tych w nowotworowych liniach komórkowych. Zbadaliśmy również poziom ekspresji innej izoformy CAP, CAP2, i stwierdziliśmy, że komórki PANC-1 i Mia PaCa-2 miały znacznie podwyższony poziom ekspresji CAP2 w porównaniu z komórkami hTERT-HPNE (Rys. 1A).
Podwyższona fosforylacja S308/S310 na CAP1, ale nie podwyższona ekspresja CAP1, została wykryta w komórkach raka trzustki. (A) Western blot ujawnia obfite poziomy ekspresji CAP1 porównywalne z poziomem w komórkach HeLa zostały wykryte we wszystkich czterech nowotworowych liniach komórkowych, a kontrolne komórki trzustki (hTERT-HPNE) mają podobny poziom ekspresji CAP1. Wyniki CAP2 blot pokazują, że komórki raka PANC-1 i Mia PaCa-2 wyrażają obfite poziomy CAP2, które były znacznie wyższe niż w kontrolnych komórkach hTERT-HPNE. (B) Western blot ujawnia podwyższoną fosforylację S308/S310 na CAP1 w komórkach raka trzustki PANC-1 i CFPAC-1 w porównaniu z komórkami nieprzekształconej trzustki hTERT-HPNE. Przeciwciało specyficzne dla fosforu rozpoznaje sygnały fosforowe na obu resztach. Wyrównane sekwencje na górze pokazują sekwencje, które otaczają tandemowe miejsce fosfororegulacyjne. Reszty serynowe (S307 & S309 na mysim CAP1; S308 & S310 na ludzkim CAP1) w tandemowym miejscu są zaznaczone pogrubieniem i kursywą (również podkreślone). Sygnały fosforowe zostały określone ilościowo za pomocą densytometrii, a wyniki z trzech eksperymentów zostały przeanalizowane w teście t-Studenta i wykreślone na wykresie, gdzie słupki błędów reprezentują S.E.M. „*” oznacza P < 0,05 i „**” oznacza P < 0,01. (C) Traktowanie komórek inhibitorem GSK3 6-BIO przez 16 godzin znacząco zmniejszyło fosforylację CAP1 zarówno w komórkach raka trzustki PANC-1, jak i komórkach hTERT-HPNE, w sposób zależny od dawki. 6-BIO zmniejszał również fosforylację CAP1 w komórkach CFPAC-1 w podobny sposób (nie pokazano). GAPDH służy jako kontrola obciążenia w Western blotting.
Wcześniej donosiliśmy, że GSK3 fosforyluje S309 na mysim CAP124 (odpowiednik S310 na ludzkim CAP1; wyrównane sekwencje pokazane na ryc. 1B). Biorąc pod uwagę doniesienia o nadmiernej aktywacji GSK3 w raku trzustki25, zbadaliśmy potencjalne zwiększenie fosforylacji S308/S310 na CAP1 w komórkach nowotworowych, używając przeciwciała specyficznego dla fosforu, które rozpoznaje sygnały fosforowe na obu resztach serynowych w Western blotting24. Co ciekawe, fosforylacja S308/310 była znacząco podwyższona w komórkach nowotworowych w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Figura 1B, pokazana z danymi ilościowymi tylko dla linii komórkowych PANC-1 i CFPAC-1, ale podobne wyniki uzyskano z komórkami AsPC-1 i Mia PaCa-2). Następnie zahamowaliśmy GSK3 przez traktowanie komórek nowotworowych silnym inhibitorem GSK3 6-BIO (6-bromoindirubin-3′-oxime)31 i stwierdziliśmy, że leczenie to zmniejszyło fosforylację S308/S310 na CAP1 w komórkach PANC-1 i CFPAC-1, w sposób zależny od dawki (Fig. 1C, pokazana tylko dla komórek PANC-1). Leczenie 6-BIO również zmniejszyło fosforylację CAP1 w kontrolnych komórkach trzustki. Konsekwentnie, bardziej selektywny inhibitor GSK3, LiCl32, również zmniejszył fosforylację CAP1 w komórkach PANC-1 i AsPC-1, jak pokazano później. Wyniki te potwierdzają, że GSK3 jest również częścią mechanizmu fosforylacji CAP1 na S308/S310 w komórkach raka trzustki. Zauważono również, że traktowanie komórek nowotworowych i komórek kontrolnych 6-BIO konsekwentnie prowadziło do zauważalnego wzrostu regulacji CAP1, poprzez nieznany mechanizm.
Knockdown of CAP1 led to enhanced stress fibers as well as reduced motility and invasion of cancer cells
We next attempted to silence CAP1 to determine the roles of CAP1 in pancreatic cancer cells. Stabilny paradygmat knockdown, który wcześniej opracowaliśmy, jest zgodny ze strategią ratunkową, która pozwala na weryfikację specyficzności fenotypów pochodzących z deplecji CAP112,18,24. Używając dwóch konstruktów shRNA S2 i S3, które celują w niezależne sekwencje nukleotydowe i skutecznie wyciszają CAP1 w komórkach HeLa i raka piersi12,18,24,33, byliśmy w stanie wygenerować stabilne klony z wydajnym knockdownem CAP1 w komórkach PANC-1 i AsPC-1, jak potwierdzono w Western blotting (Fig. 2A). Po dwa stabilne klony znokautowane pochodzące z PANC-1 (S2-1 i S3-3) oraz AsPC-1 (S2-3 i S2-7) zostały utworzone odpowiednio poprzez selekcję neomycyną. Próby wyciszenia CAP1 w liniach komórkowych CFPAC-1 i Mia PaCa-2 zakończyły się niepowodzeniem. Komórki CFPAC-1 nie tworzyły kolonii po selekcji antybiotykowej, podczas gdy żadna z około dwóch tuzinów stabilnych kolonii nie wykazywała znaczącej redukcji ekspresji CAP1 w komórkach Mia PaCa-2 (dane nie pokazane).
Znokautowanie CAP1 w komórkach nowotworowych prowadziło do wzmocnienia włókien naprężenia aktyny oraz zmniejszenia ruchliwości i inwazji komórek. (A) Efektywny knockdown CAP1 w dwóch stabilnych klonach dla komórek PANC-1 i AsPC-1, jak potwierdzono w Western blotting. CAP1 został wykryty w Western blotting, gdzie GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia. (B) Deplecja CAP1 w komórkach PANC-1 prowadziła do wzmocnienia włókien naprężenia aktyny. W komórkach kontrolnych, które mają pusty wektor dla shRNA (Vec), było bardzo mało włókien naprężenia aktyny (zaznaczone strzałkami). W przeciwieństwie do tego, w komórkach pozbawionych CAP1 (S2-1 i S3-3), włókna naprężenia aktyny były wzmocnione (oznaczone strzałkami), jak zaobserwowano w mikroskopii fluorescencyjnej po barwieniu falloidyną. (C) Pozbawienie CAP1 zmniejszyło ruchliwość zarówno komórek PANC-1 jak i AsPC-1, co wykryto w testach gojenia ran i migracji Transwell (tylko dla PANC-1). W przypadku testów migracji Transwell, ~ 2 × 104 komórki pozbawione surowicy przez noc zostały załadowane na każdą wkładkę umieszczoną w studzience załadowanej pożywką zawierającą surowicę. Po 16 godzinach, migrujące komórki były oceniane, a dane z trzech niezależnych eksperymentów zostały zebrane, przeanalizowane przy użyciu testu t-Studenta i wykreślone na wykresie, gdzie słupki błędów reprezentują S.E.M. „*” oznacza P < 0,05 w porównaniu z tym w komórkach kontrolnych niosących pusty wektor (Vec). (D) Deplecja CAP1 zmniejszyła inwazję Matrigel w komórkach PANC-1. Testy, zbieranie danych i analizy przeprowadzono podobnie jak w testach migracji Transwell, z wyjątkiem tego, że membrany wkładek były wstępnie pokryte Matrigel. „*” oznacza P < 0,05 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. (E) Zmniejszona EMT w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1, jak wskazano przez zwiększoną ekspresję E-Cadherin, jak również zmniejszone poziomy ekspresji Vimentin w stabilnych klonach CAP1-knockdown. GAPDH służy jako kontrola obciążenia w Western blots.
W pierwszej kolejności zbadaliśmy zmiany morfologiczne i cytoszkieletu aktyny w komórkach CAP1-knockdown PANC-1 i AsPC-1. W przeciwieństwie do zwiększonego rozmiaru komórek w CAP1-knockdown HeLa i komórkach przerzutowego raka piersi12,18,24, pozbawienie CAP1 nie spowodowało zauważalnego wzrostu rozmiaru komórek PANC-1 lub AsPC-1. Następnie wybarwiliśmy cytoszkielet aktyny w komórkach PANC-1 za pomocą falloidyny, po czym wykonaliśmy mikroskopię fluorescencyjną. Komórki PANC-1 (i ogólnie komórki raka trzustki) wydają się mieć słabo zorganizowane struktury cytoszkieletu aktynowego, szczególnie pod względem włókien naprężeniowych (ryc. 2B), w porównaniu z liniami komórkowymi powszechnie używanymi do badania cytoszkieletu aktynowego, takimi jak fibroblasty HeLa i NIH3T312,24. Niemniej jednak, wzmocnione włókna naprężeniowe były widoczne w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Ryc. 2B). Wszystkie 26 komórek kontrolnych, w których badano pusty wektor, wykazywało bardzo ograniczoną obecność włókien naprężeniowych. W przeciwieństwie do tego, 20 z 27 (74.1%) badanych komórek S2-1 i 18 z 23 (78.3%) badanych komórek S3-3 CAP1-knockdown miało znacznie powiększone włókna naprężeniowe, podobnie jak to pokazano na Fig. 2B. Akumulacja włókien naprężeniowych była konsekwentnie obserwowana w innych komórkach z CAP1 deplecji12,13, fenotyp, który jest uważany za pochodzący z utraty obu funkcji CAP1 w sekwestracji monomerów aktyny i w promowaniu obrotu filamentu aktyny.
Zgodnie z wzmocnionymi włóknami naprężeniowymi, deplecja CAP1 została zgłoszona do zmniejszenia ruchliwości w wielu typach komórek ssaków, w tym komórek nowotworowych13,14,17,18,19. Stwierdzono również, że przejściowe wyłączenie CAP1 w komórkach raka trzustki zmniejsza ruchliwość komórek w testach gojenia ran14. Zbadaliśmy wpływ trwałego wyłączenia CAP1 na inwazyjność komórek raka trzustki, przeprowadzając testy gojenia ran, testy migracji Transwell oraz testy inwazji Matrigel. Pozbawienie CAP1 znacząco zmniejszyło ruchliwość komórek w testach gojenia ran zarówno dla komórek PANC-1 jak i AsPC-1 (Rys. 2C), co jest zgodne z wcześniejszymi wynikami14. Rany w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1 (zarówno S3-3 jak i S2-1) goiły się tylko nieznacznie po 24 godzinach od wprowadzenia, podczas gdy w komórkach kontrolnych szczelina była prawie całkowicie wypełniona. Podobne efekty obserwowano w stabilnych, pozbawionych CAP1 klonach AsPC-1 S2-3 i S2-7 (ryc. 2C). Wyniki badań migracji komórek PANC-1 metodą Transwell były zgodne z wynikami badań gojenia ran, jak pokazano na wykresie wyników ilościowych w dolnym panelu (ryc. 2C). Co więcej, testy inwazyjne ujawniły, że pozbawienie CAP1 również zmniejszyło zdolność komórek raka PANC-1 do penetracji i inwazji przez Matrigel (Rys. 2D). Analiza t-testem Studenta danych zebranych z trzech niezależnych testów wykazała istotnie zmniejszoną inwazję stabilnych komórek PANC-1 pozbawionych CAP1 (ryc. 2D). Wreszcie, ponieważ EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) jest związany z inwazyjnością komórek nowotworowych, sprawdziliśmy potencjalny wpływ wyłączenia CAP1 na EMT. Rzeczywiście, komórki PANC-1 pozbawione CAP1 miały podwyższoną regulację E-Cadheryny, co wskazuje na zmniejszoną EMT (Rys. 2E). Zbadaliśmy również inny marker EMT, Vimentin, i stwierdziliśmy, że pozbawienie CAP1 zmniejszyło jego ekspresję (Rys. 2E). Łącznie wyniki te potwierdzają wymaganą rolę CAP1 w inwazyjności i EMT w komórkach nowotworowych PANC-1.
Zahamowanie GSK3, które hamuje fosforylację CAP1, zmniejszyło ruchliwość i inwazję komórek nowotworowych
Nasze wcześniejsze ustalenia sugerują, że przejściowa fosforylacja jest kluczowa dla funkcji CAP1 w regulacji cytoszkieletu aktynowego24. Podwyższona fosforylacja CAP1 w komórkach raka trzustki, zgodna z aktywowaną GSK3, sugeruje, że fosforegulacja może również odgrywać rolę w funkcji CAP1 w inwazyjności komórek nowotworowych. Sprawdziliśmy tę możliwość poprzez zahamowanie GSK3, która tłumi fosforylację S308/S310 i w międzyczasie zaburza regulację CAP1 poprzez przejściową fosforylację w miejscu regulacyjnym. Komórki PANC-1 poddano działaniu 6-BIO, a następnie przeprowadzono testy migracji i inwazji komórek. W pierwszej kolejności badano wpływ zmniejszonej fosforylacji S308/S310 na CAP1, poprzez traktowanie 5 μM 6-BIO (Rys. 1C). Jak pokazano na Rys. 3A, traktowanie 6-BIO znacząco zmniejszyło ruchliwość komórek PANC-1 zarówno w teście gojenia ran, jak i w teście migracji Transwell. Potwierdziliśmy również, że traktowanie komórek PANC-1 i AsPC-1 innym inhibitorem GSK3, LiCl, zmniejszyło fosforylację CAP1, jak również ruchliwość komórek w testach gojenia ran (Rys. 3A,B). Ponadto, leczenie 6-BIO zmniejszyło również inwazję komórek PANC-1 przez Matrigel (Rys. 3C). Wreszcie, ponieważ wiadomo, że GSK3 reguluje szeroki zakres funkcji komórkowych za pośrednictwem wielu cząsteczek substratowych, wpływ inhibicji GSK3 na ruchliwość komórek jest prawdopodobnie zbiorowym wyjściem poprzez wiele celów GSK3, które są zaangażowane w regulację cytoszkieletu, polaryzację komórek i migrację34,35. Dlatego przetestowaliśmy i porównaliśmy efekty 6-BIO w zmniejszaniu ruchliwości komórek w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1 i komórkach kontrolnych. Jak pokazano na wykresie na Rys. 3D, leczenie 6-BIO znacząco zmniejszyło ruchliwość komórek kontrolnych (Vec), ale nie komórek CAP1-knockdown (S2-1 i S3-3) w testach gojenia ran. Łącznie, wyniki te potwierdzają, że fosforylacja poprzez S308/S310 odgrywa ważną rolę dla CAP1 w promowaniu ruchliwości i inwazji w komórkach raka trzustki.
Zahamowanie GSK3, które zmniejszyło fosforylację CAP1, również pogorszyło ruchliwość i inwazję komórek nowotworowych. (A) Leczenie komórek PANC-1 za pomocą 6-BIO lub LiCl zmniejszyło ruchliwość komórek w testach gojenia ran i migracji Transwell. Leczenie 100 mM LiCl skutecznie zmniejszyło fosforylację CAP1 w komórkach PANC-1. Testy migracji Transwell z komórkami PANC-1 przeprowadzono podobnie jak opisano na Rys. 2, gdzie NT oznacza komórki bez traktowania 6-BIO. (B) Traktowanie 100 mM LiCl również wyraźnie zmniejszyło fosforylację CAP1 w komórkach AsPC-1, jak również ruchliwość komórek w testach gojenia ran. (C) Traktowanie komórek PANC-1 5 μM 6-BIO znacząco zmniejszyło inwazję komórek nowotworowych w testach inwazji Matrigel. Testy inwazji Matrigel, w tym zbieranie danych i analizy, przeprowadzono podobnie jak opisano w Fig. 2D. (D) Zablokowanie CAP1 w komórkach PANC-1 osłabiło efekt 6-BIO w zmniejszaniu ruchliwości komórek w testach gojenia ran. Kontrolne i pozbawione CAP1 stabilne klony PANC-1 hodowano przez 16 godzin po wprowadzeniu rany, a przerywane linie wskazują krawędzie początkowej szczeliny. Ruchliwość komórek została określona ilościowo, przeanalizowana za pomocą testu t-Studenta i przedstawiona na wykresie, gdzie słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. „*” wskazuje P < 0,05 i „**” wskazuje P < 0,01.
Fosforowe mutanty CAP1 miały upośledzone funkcje w łagodzeniu wzmocnionych włókien stresu i promowaniu rozwoju lamellipodii w CAP1-knockdown komórek PANC-1
Nasze odkrycia z komórek CAP1-knockdown wspierają, że CAP1 jest wymagany dla ruchliwości i inwazji komórek nowotworowych, a wyniki z inhibicji GSK3 sugerują, że fosforylacja S308/S310 odgrywa kluczową rolę w funkcjach CAP1. Następnie zastosowaliśmy strategię reekspresji w celu dalszego ustalenia tych przypadków. Dziki typ CAP1 (WTCAP1) i mutanty fosforowe, które naśladują albo fosforylowane (S307D/S309D; DD) lub niefosforylowane (S307A/S309A; AA) formy CAP1, jak opisano wcześniej12,18,24, były trwale reekspresjonowane w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1, aby sprawdzić ich zdolność do ratowania fenotypów cytoszkieletu aktyny i morfologii komórek. Mutanty te zawierają niedopasowania do docelowej sekwencji S3 shRNA, aby uniknąć rozpoznania pochodnych mRNA przez shRNA trwale obecne w komórkach znokautowanych, ale bez zmiany jakiegokolwiek aminokwasu w CAP112. Byliśmy w stanie stworzyć stabilne klony, które reeksprymowały WT mysiego CAP1 lub mutanta fosforowego AA i DD, co zostało potwierdzone w Western blotting przeciwko znacznikowi 6xHis (Fig. 4A). Należy zauważyć, że dwa nieistotne pasy zostały usunięte z oryginalnego obrazu Western blot (próbki w tych dwóch pasach zostały użyte do potwierdzenia reekspresji dwóch mutantów fosforowych seryny 36 na N-końcu). Cały zestaw oryginalnych wyników Western blot jest pokazany na Uzupełniającym Rys. 1. Morfologia komórek reekspresjonujących mutanta AA (AA-R) lub DD (DD-R) została zbadana w mikroskopii fazowej i porównana z morfologią komórek reekspresjonujących WTCAP1 (WT-R). Stwierdzono, że knockdown CAP1 w niektórych typach komórek ssaków, w tym HeLa i komórkach przerzutowego raka piersi, prowadził do znacznego zwiększenia rozmiaru komórek12,13,18, fenotyp, który wcześniej potwierdziliśmy jako specyficzny dla knockdown CAP112,18. Znokautowanie CAP1 w komórkach PANC-1 lub komórkach AsPC-1 nie wykazało jednak tego efektu. Wręcz przeciwnie, stabilna reekspresja WTCAP1 lub mutantów fosforowych w znokautowanych komórkach faktycznie znacząco zwiększyła rozmiar komórek (Fig. 4B). Co więcej, reekspresja WTCAP1 prowadziła do rozwoju solidnej wielkości lamellipodiów (oznaczonych strzałkami), subkomórkowej struktury bogatej we włóknistą aktynę, która jest krytyczna dla kierunkowego ruchu komórek (Fig. 4C), podczas gdy praktycznie żadna z komórek znokautowanych, posiadających pusty wektor kontrolny, nie rozwinęła takich lamellipodiów. Reekspresja mutantów AA lub DD również do pewnego stopnia stymulowała powstawanie lamellipodii, ale ich rozmiary były zauważalnie mniejsze w porównaniu z komórkami reeksprymującymi WTCAP1 (zaznaczone strzałkami na Rys. 4C). Policzyliśmy 200 komórek dla każdego typu komórek, a odsetki komórek, w których pojawiły się duże lamellipodia wynosiły: 0% (0/200) dla komórek knockdown (Vec), 14,5% (29/200) dla komórek WT-R oraz 9% (18/200) i 7,5% (15/200), odpowiednio, dla komórek AA-R i DD-R.
Wpływ ponownej ekspresji WTCAP1 i mutantów fosforu w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1 na cytoszkielet aktyny, rozmiar komórek i rozwój lamellipodii. (A) Potwierdzenie reekspresji WTCAP1 i mutantów fosforowych AA i DD w stabilnych komórkach S3-3 CAP1-knockdown PANC-1 w Western blotting z użyciem przeciwciała przeciwko znacznikowi 6xHis. Dwa nieistotne pasy zostały usunięte z oryginalnego obrazu Western blot (pokazanego w Supplementary Fig. 1); (B) dane ilościowe pokazujące znacząco zwiększony rozmiar komórek w komórkach reekspresjonujących WTCAP1 lub mutanty fosforowe w komórkach CAP1-knockdown. Rozmiary 50 komórek w każdym polu mierzono przy użyciu programu Image-J. Dane analizowano za pomocą testu t-Studenta i przedstawiono na wykresie, gdzie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. „*” oznacza P < 0,05 w porównaniu z komórkami kontrolnymi niosącymi pusty wektor (Vec-R). (C) Obrazy fazowe pokazują, że reekspresja WTCAP1 lub mutantów fosforu stymulowała tworzenie się lamellipodii. Niektóre z komórek reekspresjonujących WTCAP1 (WT-R) wykształciły wyjątkowo duże lamellipodia (zaznaczone strzałkami). Reekspresja mutantów AA (AA-R) lub DD (DD-R) również symulowała tworzenie się lamellipodii, ale ich rozmiary są wyraźnie mniejsze w porównaniu z tymi w komórkach reeksprymujących WTCAP1. Takich lamellipodii nie zaobserwowano w kontrolnych komórkach pozbawionych CAP1 i zawierających pusty wektor (Vec-R). (D) Ponowna ekspresja WTCAP1 w komórkach CAP1-knockdown PANC-1 zredukowała włókna naprężeniowe, podczas gdy komórki reekspresjonujące mutanty miały wzmocnione włókna naprężeniowe. Komórki reekspresjonujące fosfomimetyczny mutant DD miały najbardziej wzmocnione włókna stresowe. Strzałki wskazują włókna stresu, lub ich brak w przypadku komórek WT-R.
Następnie przyjrzeliśmy się możliwościom mutantów fosforu w łagodzeniu wzmocnionych włókien stresu w CAP1-knockdown PANC-1 komórek. Jak pokazano na obrazach konfokalnych na Rys. 4D, ponowna ekspresja WTCAP1 (WT-R) skutecznie złagodziła wzmocnione włókna stresu, ratując fenotyp, a włókna stresu zostały rozpuszczone w dużych obszarach wskazanych strzałką. W przeciwieństwie do tego, mutanty fosforowe były mniej skuteczne w łagodzeniu wzmocnionych włókien stresu. Komórki reekspresjonujące mutanta AA miały umiarkowanie wzmocnione włókna stresowe niż komórki ratowane przez WTCAP1, podczas gdy komórki reekspresjonujące mutanta DD wydawały się mieć jeszcze bardziej wzmocnione włókna stresowe. Wyniki te są zgodne z naszymi wcześniejszymi odkryciami z komórek HeLa, które sugerują, że fosforylowana CAP1 jest formą „aktywną” w stosunku do fosforylowanej CAP124, podczas gdy przejściowa fosforylacja jest uważana za wymaganą dla optymalnych funkcji komórkowych CAP1. Wyniki te sugerują również, że przejściowa fosforylacja S308/S310 jest ważna dla CAP1 do regulacji cytoszkieletu aktynowego w komórkach raka trzustki; zakłócenie regulacji poprzez przejściową fosforylację prowadzi do defektów w funkcji CAP1 w promowaniu obrotu filamentu aktynowego.
Mutanty fosforowe CAP1 miały defekty w ratowaniu zmniejszonej inwazyjności w komórkach rakowych pozbawionych CAP1
Ponieważ dynamiczny obrót filamentów aktynowych jest główną siłą napędową ruchu komórek, sprawdziliśmy jak dobrze mutanty fosforowe ratują zmniejszoną ruchliwość komórek i inwazję w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1. Najpierw przeprowadziliśmy testy migracji Transwell i stwierdziliśmy, że reekspresja WTCAP1 znacząco zwiększyła ruchliwość komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które były wyposażone w pusty wektor, jak pokazano w ilościowych wynikach na wykresie (Rys. 5A). Reekspresja mutanta AA (AA-R), chociaż nie tak skuteczna jak WTCAP1, częściowo ratowała zmniejszoną ruchliwość komórek w testach migracji Transwell. W przeciwieństwie do tego, mutant DD (DD-R) nie uratował zmniejszonej ruchliwości komórek, a tempo było porównywalne do tego w komórkach pozbawionych CAP1 i zawierających pusty wektor. Wyniki te są spójne z możliwościami ratowania wzmocnionych włókien stresowych przez WTCAP1 i mutanty fosforowe. Dalej testowaliśmy ratowanie zmniejszonej inwazji Matrigel w komórkach CAP1-knockdown, jak pokazano w ilościowych wynikach na Rys. 5B. Podobnie, WTCAP1 uratował zmniejszoną inwazję w komórkach CAP1-knockdown PANC-1 najbardziej efektywnie; mutant AA osiągnął częściowy ratunek, podczas gdy mutant DD dosłownie nie uratował fenotypu. Wreszcie, ponowna ekspresja WTCAP1 w komórkach pozbawionych CAP1 również zmniejszyła ekspresję E-Cadheryny (Rys. 5C), co dodatkowo potwierdza, że CAP1 jest wymagany dla EMT w komórkach raka PANC-1. Łącznie, wyniki te potwierdzają, że fosforegulacja poprzez tandemowe miejsce S308/S310 odgrywa ważną rolę dla CAP1 w promowaniu ruchliwości i inwazji komórek raka trzustki.
Wpływ WTCAP1 i mutantów fosforowych w ratowaniu zmniejszonej ruchliwości i inwazji w komórkach CAP1-knockdown PANC-1. (A) WTCAP1 i mutant AA skutecznie ratowały zmniejszoną ruchliwość komórek CAP1-knockdown PANC-1 w testach migracji Transwell, podczas gdy mutant DD nie zdołał tego osiągnąć. Eksperymenty, zbieranie danych i analizy były prowadzone podobnie do tych opisanych na Rys. 2. Słupki błędów reprezentują S.E.M., a „*” oznacza P < 0,05 w porównaniu z komórkami kontrolnymi niosącymi pusty wektor (Vec-R). (B) WTCAP1 i mutant AA skutecznie ratowały zmniejszoną inwazję Matrigel komórek PANC-1 pozbawionych CAP1, podczas gdy mutant DD również tego nie robił. Eksperymenty, zbieranie danych i analizy przeprowadzono podobnie jak w przypadku opisanym na Rys. 2. Słupki błędów reprezentują S.E.M., a „*” oznacza P < 0,05 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. (C) Ponowna ekspresja WTCAP1 również uratowała wyregulowaną E-Cadherin w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1.
Dowody potwierdzające, że CAP1 pośredniczy w przekazywaniu sygnałów zewnątrzkomórkowych czynników wzrostu w celu kontroli inwazyjności komórek nowotworowych
Bodźce fizjologiczne, takie jak czynniki wzrostu PDGF i HGF (Hepatocyte Growth Factor)36, są znane z pobudzania rearanżacji cytoszkieletu aktynowego i migracji komórek. Ponieważ fosforylacja przy S308/S310 jest kluczowa dla funkcji CAP1 w regulacji cytoszkieletu aktynowego i inwazyjności komórek nowotworowych, zbadaliśmy możliwość, że te bodźce mogą regulować fosforylację CAP1, a przez to kontrolować rearanżację cytoszkieletu aktynowego i inwazyjność komórek nowotworowych. Co ciekawe, traktowanie komórek PANC-1 i AsPC-1 pozbawionych surowicy z PDGF zmniejszyło fosforylację S308/S310 na CAP1, najbardziej zauważalnie w 5-minutowym punkcie czasowym (Fig. 6A,B). Traktowanie komórek raka trzustki HGF lub surowicą nie miało znaczącego wpływu na indukowanie dephosforylacji CAP1 (Supplementary Fig. 2; pokazane dla komórek PANC-1). Dlatego też sygnalizacja poprzez CAP1 jest prawdopodobnie przynajmniej częściowo odpowiedzialna za stymulowanie przez PDGF reorganizacji cytoszkieletu aktyny i inwazyjności komórek nowotworowych. Wyniki te są również zgodne z poglądem, że zdepofosforylowana CAP1 jest formą „aktywną”, co sugerują liczne dowody, w tym wiązanie kofiliny, subkomórkowa lokalizacja mutantów fosforowych i podwyższona fosforylacja CAP1 w komórkach hodowanych w zawiesinie24. Uważa się jednak, że przejściowa fosforylacja w tandemowym miejscu regulacyjnym, a mianowicie cykliczne przechodzenie między formą fosforylowaną i zdeposforylowaną, jest wymagane dla optymalnych funkcji komórkowych CAP124. Sygnały deposforylacji CAP1 prawdopodobnie funkcjonują w kohortach z sygnałami fosforylacji CAP1, aby regulować funkcje komórkowe CAP1 poprzez napędzanie przejściowej fosforylacji na S308/S310.
PDGF indukował deposforylację CAP1 w komórkach raka trzustki. (A) Traktowanie komórek raka AsPC-1 pozbawionych surowicy PDGF indukowało deposforylację CAP1 na S308/S310. Komórki były hodowane przez noc, pozbawiane surowicy przez 24 godziny, a następnie poddawane działaniu 30 ng/ml PDGF przez wskazany czas. Lizaty komórkowe zostały przygotowane i użyte w Western blotting z przeciwciałem specyficznym dla fosforu, które wykrywa sygnały fosforowe na obu resztach tandemowego miejsca regulacyjnego na CAP1. Efekt dephosphorylacji był najbardziej znaczący w 5-minutowym punkcie czasowym traktowania PDGF. (B) Traktowanie komórek PANC-1 pozbawionych surowicy PDGF również indukowało znaczną deposforylację CAP1, w podobny sposób jak w przypadku komórek AsPC-1. Traktowanie komórek i Western blotting przeprowadzono zgodnie z tymi samymi procedurami, które zastosowano dla komórek AsPC-1. GAPDH służyła jako kontrola obciążenia w Western blot.
Deplecja CAP1 w komórkach raka trzustki zmniejszyła aktywność FAK, ale nie spowodowała zmian w ERK lub proliferacji komórek
Ostatnio zidentyfikowaliśmy nową rolę CAP1 w regulacji proliferacji komórek raka piersi, gdzie deplecja CAP1 wywiera zależny od kontekstu komórkowego wpływ na proliferację, któremu towarzyszą spójne zmiany w aktywności ERK18. Sprawdziliśmy, czy CAP1 może również regulować ERK i proliferację w komórkach raka trzustki. Nie wykryto znaczących zmian w ekspresji lub fosforylacji ERK w stabilnych klonach PANC-1 pozbawionych CAP1 w porównaniu do komórek kontrolnych (Supplementary Fig. 3A). Przeprowadziliśmy również testy MTT badające proliferację komórek S2-1 i S3-3, porównując je z komórkami kontrolnymi (Vec), i wykryliśmy nieznacznie zmniejszone tempo proliferacji komórek w komórkach poddanych knockdown (Supplementary Fig. 3B). Jednakże różnice te były statystycznie nieistotne, z wartościami P porównującymi O.D. (przy 570 nm) pomiędzy komórkami S2-1 i komórkami kontrolnymi na poziomie 0.219, oraz pomiędzy komórkami S3-3 i komórkami kontrolnymi na poziomie 0.223. Wyniki te wskazują, że CAP1 nie odgrywa znaczącej roli w regulacji proliferacji w komórkach raka trzustki. Co więcej, biorąc pod uwagę ogólną tendencję, że paradygmat stabilnego knockdown jest podatny na wariacje klonów, wygenerowaliśmy pulę stabilnie znokautowanych komórek CAP1 PANC-1, które, jak się uważa, dokładniej odzwierciedlają efekty deplecji CAP1 na ERK, poprzez unikanie potencjalnego wpływu stronniczości selekcji. Jak pokazano na Rys. 7A, pule stabilnych komórek PANC-1 z efektywnym znokautowaniem CAP1, pochodzących z obu konstrukcji S2 i S3 shRNA, zostały utworzone po selekcji neomycyną, jak potwierdzono w Western blotting. Zgodnie z wynikami uzyskanymi przy użyciu stabilnych klonów znokautowanych, nie wykryto znaczących zmian w ekspresji ERK lub jej fosforylacji w komórkach puli znokautowanych w porównaniu z komórkami kontrolnymi.
Komórki puli PANC-1 znokautowane CAP1 miały zmniejszoną aktywność FAK i adhezję komórek, ale bez zmian w ERK. (A) Komórki PANC-1 pozbawione CAP1, pochodzące z konstruktów shRNA S2 i S3, nie wykazywały zmienionej ekspresji lub aktywności ERK w porównaniu z komórkami kontrolnymi posiadającymi pusty wektor, co wykryto metodą Western blotting. Aktywność ERK była wykrywana w Western blotting przy użyciu fosforospecyficznego przeciwciała przeciwko miejscom Thr202/Tyr204. GAPDH służył jako kontrola obciążenia. (B) Zmniejszona aktywność FAK została wykryta w komórkach PANC-1 pozbawionych CAP1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Aktywność FAK została oceniona przez fosforylację przy Tyr397, przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosforu przeciwko temu miejscu w Western blotting; (C) komórki puli CAP1-knockdown miały zmniejszoną adhezję komórek w badanych punktach czasowych (45 minut i 2 godziny) po umieszczeniu komórek na płytkach pokrytych fibronektyną. Około 2 × 104 komórek umieszczono na każdej studzience 6-dołkowej płytki, a komórki, które nie przylegały we wskazanych punktach czasowych, zostały wypłukane. Liczba dołączonych komórek została policzona w pięciu losowych polach pod mikroskopem fazowym i wykonano zdjęcia. (D) Dane zebrane z trzech niezależnych testów adhezji komórek analizowano przy użyciu testu t-Studenta i wykreślono na wykresie, gdzie słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. „**” Wskazuje P < 0,01 w porównaniu z komórkami kontrolnymi niosącymi pusty wektor.
Knockdown of CAP1 in breast cancer cells caused distinct alterations in FAK in the metastatic and non-metastatic breast cancer cells18. Wykryliśmy również zmniejszoną aktywność FAK, bez zmian w poziomie ekspresji FAK, w komórkach raka PANC-1 pozbawionych CAP1 (Rys. 7B). W oparciu o te wyniki sprawdziliśmy wpływ deplecji CAP1 na adhezję komórek w testach adhezyjnych, podobnie jak to robiliśmy poprzednio12,18. Stwierdziliśmy, że komórki puli pozbawione CAP1 pochodzące z obu konstruktów shRNA miały znacznie zmniejszoną adhezję komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rys. 7C). W obu punktach czasowych (45 minut i 2 godziny) po umieszczeniu komórek na powierzchni pokrytej fibronektyną, znacznie więcej komórek kontrolnych przylegało w porównaniu z komórkami CAP1-knockdown. Co więcej, więcej z przyłączonych komórek kontrolnych również w pełni się rozprzestrzeniło (rozwinęły się lamellipodia i komórki nie są tak jasne) w porównaniu do komórek CAP1-knockdown (Rys. 7C). Dla porównania oceniliśmy liczbę przyłączonych komórek z trzech pól, a dane z trzech niezależnych eksperymentów zostały skwantyfikowane w sposób przedstawiony na wykresie (Ryc. 7D).