4.3. Struktura receptorów nikotynowych
Receptor nikotynowy narządu elektrycznego i mięśni szkieletowych kręgowców jest pentamerem złożonym z czterech odrębnych podjednostek (a, b, g i d) w stosunku stechiometrycznym odpowiednio 2:1:1:1. W dojrzałych, unerwionych płytkach końcowych mięśni, podjednostka g jest zastąpiona przez e, blisko spokrewnioną podjednostkę. Poszczególne podjednostki mają w około 40% identyczne sekwencje aminokwasowe, powstałe ze wspólnego genu pierwotnego. Receptor nikotynowy stał się prototypem dla innych pentamerycznych kanałów jonowych bramkowanych ligandami, do których należały receptory dla aminokwasów hamujących (kwasu g-aminomasłowego i glicyny) oraz niektóre receptory serotoninowe (5-HT3). Każda z podjednostek pentamerycznego receptora ma masę cząsteczkową od 40 000 do 60 000 daltonów. 210 reszt amino-końcowych stanowi praktycznie całą domenę zewnątrzkomórkową. Po niej następują cztery domeny transmembranowe (TM); region pomiędzy trzecią i czwartą domeną tworzy większość składnika cytoplazmatycznego. Każda z podjednostek receptora nikotynowego ACh ma zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe ułożenie na błonie postsynaptycznej. Receptor jest asymetryczną cząsteczką (14 nm×8 nm) o masie 250 000 daltonów, z większością domeny niemembranowej znajdującej się na powierzchni zewnątrzkomórkowej. W obszarach węzłowych (np. w płytce końcowej mięśnia szkieletowego i na brzusznej powierzchni narządu elektrycznego), receptor występuje w dużych gęstościach (10 000/mm2) w regularnym porządku upakowania. Takie uporz±dkowanie receptorów pozwoliło na rekonstrukcję struktury molekularnej za pomoc± mikroskopu elektronowego. Białko wiążące ACh homologiczne tylko do zewnątrzkomórkowej domeny receptora nikotynowego zostało zidentyfikowane w ślimakach słodko- i słonowodnych i scharakteryzowane strukturalnie i farmakologicznie.
Białko to składa się jako homomeryczny pentamer i wiąże ligandy receptora nikotynowego z oczekiwaną selektywnością; jego struktura krystaliczna ujawnia atomową organizację oczekiwaną od receptora nikotynowego. Co więcej, fuzja białka wiążącego ACh i transmembranowych przęseł receptora daje funkcjonalne białko, które wykazuje bramkowanie kanału i zmiany stanu oczekiwane od receptora. To białko wi±ż±ce służy zarówno jako strukturalny, jak i funkcjonalny surogat receptora i umożliwiło szczegółowe zrozumienie czynników decyduj±cych o specyficzno¶ci ligandowej receptora nikotynowego. Miejsca wiążące agonistów znajdują się na stykach podjednostek, ale w mięśniach tylko dwa z pięciu styków podjednostek, a g i a d, ewoluowały w kierunku wiązania ligandów. Wiązanie agonistów, odwracalnych konkurencyjnych antagonistów i toksyny elapidu a wzajemnie się wyklucza i obejmuje zachodzące na siebie powierzchnie receptora. Obie podjednostki tworzące interfejs podjednostkowy przyczyniają się do specyficzności ligandów. Pomiary przewodnictwa błonowego wykazują, że szybkość translokacji jonów jest wystarczająco szybka (5×107 jonów na sekundę), aby wymagać translokacji jonów przez otwarty kanał, a nie przez wirujący nośnik jonów. Co więcej, zmiany w przepuszczalności jonów wywołane przez agonistę (typowo ruch do wewnątrz głównie Na+ i wtórnie Ca2+) zachodzą poprzez kanał kationowy wbudowany w strukturę receptora. Drugi region transmembranowy na każdej z pięciu podjednostek tworzy wewnętrzny obwód kanału. Miejsce wi±zania agonisty jest blisko sprzężone z kanałem jonowym; w receptorze mię¶niowym jednoczesne zwi±zanie dwóch cz±steczek agonisty powoduje gwałtown± zmianę konformacyjn±, która otwiera kanał. Zarówno odpowiedź wiążąca jak i bramkująca wykazują pozytywną kooperatywność. Szczegóły dotyczące kinetyki otwarcia kanału zostały opracowane na podstawie elektrofizjologicznych technik patch-clamp, które rozróżniają poszczególne zdarzenia otwarcia i zamknięcia pojedynczej cząsteczki receptora i potwierdzają, że nikotynowe receptory acetylocholinowe (nAChR) są pentamerycznymi kanałami jonowymi bramkowanymi ligandami, które składają się z podjednostek zawierających domenę zewnątrzkomórkową, która przenosi miejsce wiążące ligand i odrębną domenę jonowo-porową. Transdukcja sygnału wynika z allosterycznego sprzężenia pomiędzy tymi dwoma domenami, których odległość od miejsca wi±zania do bramki domeny porowej wynosi 50 Å. Jednakże badania wi±zania receptorów s± specyficzne dla nikotynowych receptorów cholinergicznych, które zostały przeprowadzone na izolowanych nabłonkach przedsionkowych żab Rana catesbiana i Rana temporaria. Przedstawiono dowody na obecność nikotynopodobnych receptorów cholinergicznych specyficznie związanych z obszarami czuciowymi oraz zbadano wiązanie nietypowych konformacji agonistów nikotynowych nadających selektywność podtypu i stwierdzono, że nAChR odgrywają kluczową rolę w neurotransmisji pobudzającej i stanowią ważny cel dla leków i insektycydów. Zidentyfikowano również rodzinę genów koduj±cych białka homologiczne do podjednostki α mięśniowego receptora nikotynowego acetylocholiny w genomie szczura. Geny te są transkrybowane w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym w obszarach, o których wiadomo, że zawierają funkcjonalne receptory nikotynowe. Rola neuronalnych receptorów nikotynowych (nAChRs) zawierających β2 w pośredniczeniu w skutkach ubocznych nikotyny u płodu i noworodka. Ciężarnym myszom WT i zmutowanym myszom pozbawionym podjednostki β2 nAChR wszczepiono minipompy osmotyczne, które dostarczały albo wodę, albo kontrolowaną dawkę nikotyny. Następnie zaobserwowano komparację rozwoju układu sympatyczno-nadnerczowego oraz odruchów oddechowych i pobudzenia u potomstwa krótko po urodzeniu, czyli w okresie zwiększonej podatności na ekspozycję na nikotynę. Z drugiej strony, neonikotynoidy, jak imidakloprid, są agonistami nAChR o silnym działaniu owadobójczym. Od czasu wprowadzenia na początku lat 90. imidaklopryd stał się jednym z najszerzej stosowanych insektycydów, zarówno w ochronie roślin, jak i w ochronie zdrowia zwierząt, molekularne podstawy oporności na imidaklopryd, pięć podjednostek nAChR (Nlα1-Nlα4 i Nlβ1) zostało sklonowanych z Nilaparvata lugens. Porównanie genów podjednostek nAChR z populacji wrażliwych na imidaklopryd i odpornych na imidaklopryd pozwoliło zidentyfikować pojedynczą mutację punktową w konserwatywnej pozycji (Y151S) w dwóch podjednostkach nAChR, Nlα1 i Nlα3. Silna korelacja pomiędzy częstością występowania mutacji punktowej Y151S a poziomem odporności na imidaklopryd została wykazana za pomocą PCR specyficznego dla alleli. Poprzez ekspresję hybrydowych nAChRs zawierających podjednostki α Nilaparvata lugens i β2 szczura, uzyskano dowody wskazujące, że mutacja Y151S jest odpowiedzialna za znaczne zmniejszenie specyficznego wiązania imidaklopridu. Praca ta dostarcza bezpośrednich dowodów na występowanie oporności typu target-site na neonikotynoidowy insektycyd, a także bada naturę miejsca wiązania kationu-π w receptorze nikotynowym i stwierdza, że nikotynowy receptor acetylocholinowy jest prototypowym kanałem jonowym bramkowanym ligandem. W miejscu wi±zania agonisty zidentyfikowano szereg aminokwasów aromatycznych, co sugeruje, że oddziaływania kation-π mog± być zaangażowane w wi±zanie czwartorzędowej grupy amoniowej agonisty – acetylocholiny. Konformacja cząsteczek cholinergicznych w nikotynowych receptorach nerwowych oraz znalezienie korelacji analiz struktur krystalicznych silnych agonistów nikotynowych: acetylocholiny, acetylo-α-metylocholiny, laktoilocholiny, 1,1-dimetylo-4-fenylopiperazyny i nikotyny pozwala na określenie konformacji agonistów cholinergicznych istotnych dla nikotynowych receptorów nerwowych. Ekspresja receptorów neurotransmiterowych kodowanych przez mRNA izolowane z trzech linii komórkowych glejaka ludzkiego. Oocyty, do których wstrzyknięto mRNA z dwóch linii komórkowych glejaka, nie wykazywały odpowiedzi elektrycznej na różne badane neuroprzekaźniki.
Modulacja nAChR przez strychninę Stwierdzono, że strychnina jest silnym i selektywnym antagonistą receptorów glicyny, który hamuje mięśniowe (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ, i α 1β 1δ) i neuronalne (α 2β 2 i α 2β 4) nikotynowe receptory acetylocholiny (AcChoRs) wyrażone w oocytach Xenopus. Sama strychnina (do 500 µmol/L) nie wywoływała prądów błonowych w oocytach wykazujących ekspresję AcChoRs, ale gdy zastosowano ją przed, równocześnie lub podczas superfuzji acetylocholiny (AcCho), szybko i odwracalnie hamowała prąd wywoływany przez AcCho (AcCho-prąd). Translacja egzogennego mesenger RNA kodującego nAChRs wytwarza funkcjonalne receptory w oocytach Xenopus, w tym badaniu mesenger RNA wyekstrahowany z elektrycznego narządu Torpedo został wstrzyknięty do oocytów Xenopus. Doprowadziło to do syntezy i wbudowania funkcjonalnych receptorów acetylocholiny do błony oocytu. Po aktywacji przez acetylocholinę, te receptory acetylocholiny Torpedo w błonie oocytu otwierały kanały, których przepuszczalność jonowa przypominała przepuszczalność receptorów nikotynowych w innych komórkach.
Lokalizacja receptorów acetylocholinowych (AChR) na powierzchni rozwijających się komórek miogennych przednich i tylnych mięśni latissimus dorsi zarodka pisklęcia w odniesieniu do procesu unerwienia została zbadana na poziomie ultrastrukturalnym przy użyciu koniugatu peroksydazy chrzanowej-α-bungarotoksyny. Zlokalizowane stężenia AChR stwierdzono w małych regionach o szerokości 0,1-0.4 µm na powierzchni komórek miogennych 10-14-dniowych mięśni, a także badano wpływ acetylocholiny i środków naśladujących lub blokujących jej fizjologiczne działanie na stężenie 3′ guanozyny:5′-cyklicznego monofosforanu (cyklicznego GMP) i adenozyny 3′:5′-cyklicznego monofosforanu (cyklicznego AMP) w plastrach kory mózgowej ssaków, komory serca i jelita krętego. Acetylocholina i środki cholinomimetyczne o działaniu głównie muskarynowym, takie jak metacholina, betanechol i pilokarpina, indukowały wzrost stężenia cyklicznego GMP lub niewielki spadek stężenia cyklicznego AMP, we wszystkich trzech badanych tkankach.
Właściwości funkcjonalne i lokalizacja komórkowa ludzkiego neuronalnego receptora α7 AcCho (α7 AcChoR) i jego zmutowanej formy L248T (mut) zostały zbadane przez wyrażenie ich samodzielnie lub jako fuzji genów z ulepszoną wersją zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Oocyty Xenopus, do których wstrzyknięto cDNA podjednostek typu dzikiego, mutα7 lub chimerycznych, wykazywały ekspresję receptorów, które bramkowały prądy błonowe pod wpływem AcCho. Jak już wiadomo, prądy AcCho generowane przez receptory wtα7 zanikają znacznie szybciej niż te wywoływane przez receptory mutα7. Współdziałanie receptorów nikotynowych β2 i szlaków dopaminowych w kontroli spontanicznej lokomocji i stwierdza, że acetylocholina (ACh) jest znanym modulatorem aktywności neuronów dopaminergicznych (DAergic) poprzez stymulację nAChRs. Jednak skład podjednostkowy i specyficzna lokalizacja nAChRs zaangażowanych w lokomocję indukowaną przez DA nie zostały jeszcze ustalone in vivo. Myszy pozbawione podjednostki β2 nAChRs (β2KO) wykazują uderzającą nadaktywność w terenie otwartym, co sugeruje zaburzenie równowagi w neurotransmisji DA. Jednakże mutacja w obrębie domeny M2 receptora nikotynowego przekształca 5-hydroksytryptaminę z antagonisty w agonistę, przeprowadzono badania nad wpływem 5-hydroksytryptaminy (5HT) na homomeryczne neuronalne receptory nikotynowe (nAcChoR) wyrażone w oocytach Xenopus po wstrzyknięciu cDNA kodującego podjednostkę kurczaka typu dzikiego. AcCho wywoływał duże prądy, które były redukowane przez 5HT w sposób odwracalny i zależny od dawki, z połowicznym stężeniem hamującym i współczynnikiem Hilla. Chociaż badania receptora cholinergicznego cytotoksycznych limfocytów T i agonistów cholinergicznych mają zdolność uczulonych limfocytów do ranienia komórek noszących uczulające alloantygeny, receptor cholinergiczny atakującej populacji limfocytów został zbadany z farmakologiczną manipulacją systemu in vitro, który określa ilościowo obrażenia pośredniczone przez uczulone atakujące komórki na komórkach docelowych.
.