Osoby z USA i Kanady, poproś o BEZPŁATNĄ PRÓBKĘ naszego zestawu do ekstrakcji roślinnego DNA SYNERGY™ 2.0 opartego na CTAB TUTAJ.
Isolacja DNA z tkanek roślinnych może być bardzo trudna, ponieważ biochemia pomiędzy różnymi gatunkami roślin może być ekstremalna. W przeciwieństwie do tkanek zwierzęcych, gdzie ten sam typ tkanki z różnych gatunków zazwyczaj ma podobne właściwości, rośliny mogą mieć zmienne poziomy metabolitów i strukturalnych biomolekuł. Polisacharydy i polifenole to dwie klasy biomolekuł roślinnych, które znacznie różnią się między gatunkami i są bardzo problematyczne podczas izolacji DNA. Zanieczyszczające polisacharydy i polifenole mogą przeszkadzać w manipulacjach DNA po izolacji.
Dostępne są metody, które skutecznie usuwają polisacharydy i polifenole z preparatów roślinnego DNA. Zastosowanie CTAB (bromek cetylo-trimetyloamoniowy), kationowego detergentu, ułatwia oddzielenie polisacharydów podczas oczyszczania, podczas gdy dodatki, takie jak poliwinylopirolidon, mogą pomóc w usunięciu polifenoli. Bufory ekstrakcyjne oparte na CTAB są szeroko stosowane podczas oczyszczania DNA z tkanek roślinnych.
Jedna z opcji oczyszczania DNA przy użyciu CTAB wykorzystuje fakt, że polisacharydy i DNA mają różną rozpuszczalność w CTAB w zależności od stężenia chlorku sodu. Przy wyższych stężeniach soli, polisacharydy są nierozpuszczalne, podczas gdy przy niższych stężeniach DNA jest nierozpuszczalny. W związku z tym, poprzez dostosowanie stężenia soli w lizatach zawierających CTAB, polisacharydy i DNA mogą być różnie wytrącane.
Polifenole są związkami, które zawierają więcej niż jeden pierścień fenolowy (np. tanina), strukturę, która wiąże się bardzo wydajnie z DNA. Występują one naturalnie w roślinach, ale są również generowane, gdy rośliny mają uszkodzenia tkanek (brązowienie). Po homogenizacji tkanek roślinnych, polifenole są syntetyzowane przez uwolnioną oksydazę polifenolową. Dodanie poliwinylopirolidonu zapobiega interakcji DNA i pierścieni fenolowych poprzez wiązanie polifenoli.
Protokoły oparte na CTAB mają tendencję do pracy bardzo dobrze, ale jedną znaczącą wadą jest to, że ekstrakcje chloroformowe są rutynowo stosowane do oddzielenia organicznych cząsteczek rozpuszczalnych od DNA. Ponieważ chloroform jest rakotwórczy, wiele instytucji odrzuca jego użycie. Dlatego też firma OPS Diagnostics opracowała alternatywną metodę, w której unika się chloroformu; można ją znaleźć na stronie Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.
Materiały
- Bufor CTAB: 2% bromek cetylo-trimetyloamoniowy, 1% poliwinylopirolidon, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, lub CTAB Extraction Buffer
- Wirówka (do 14,000 x g)
- RNase A Solution
- Isopropanol
- 70% Ethanol
- 2 ml probówki wirówkowe
- SpeedVac
- TE Buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Metoda
Próbki roślin mogą być przygotowane przez kriogeniczne rozdrobnienie tkanki w moździerzu i tłuczku po schłodzeniu w ciekłym azocie. Liofilizowane rośliny mogą być mielone w temperaturze pokojowej. W obu przypadkach, drobny proszek jest najlepszy do ekstrakcji DNA.
- Na każde 100 mg homogenizowanej tkanki użyć 500 µl CTAB Extraction Buffer. Wymieszać i dokładnie wytrzepać. Przenieść homogenat do łaźni o temperaturze 60°C na 30 minut.
- Po okresie inkubacji odwirować homogenat przez 5 min. przy 14 000 x g.
- Przeniesienie supernatantu do nowej probówki. Dodać 5 µl roztworu A RNazy i inkubować w temperaturze 37°C przez 20 minut
- Dodać równą objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1). Wirować przez 5 sekund, a następnie odwirowywać próbkę przez 1 minutę przy 14 000 x g w celu rozdzielenia faz. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki. Powtarzać tę ekstrakcję, aż górna faza będzie klarowna.
- Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki. Wytrącić DNA przez dodanie 0,7 objętości zimnego izopropanolu i inkubować w temperaturze -20°C przez 15 minut.
- Wirować próbkę przy 14,000 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant, nie naruszając osadu, a następnie przemyć 500 µl lodowatego 70% etanolu. Zdekantować etanol. Usunąć resztki etanolu przez suszenie w suszarce SpeedVac.
- Suszyć osad wystarczająco długo, aby usunąć alkohol, ale bez całkowitego wysuszenia DNA. Rozpuścić DNA w 20 µl buforu TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Granulat może wymagać podgrzania w celu rozpuszczenia.
Opcjonalny protokół:
Użycie krzemionkowych kolumn spinowych może dać wyższą jakość DNA. Aby zapoznać się z protokołem opcjonalnym, kliknij tutaj.