Relationship between Aortic Arch Calcification, Detected by Chest X-Ray, and Renal Resistive Index in Patients with Hypertension

Abstract

Objective: Zwapnienie łuku aorty (AAC) jest markerem zastępczym dla sztywności tętnic i uszkodzenia naczyń związanego z nadciśnieniem tętniczym. Wskaźnik oporu nerkowego (RRI), parametr ultrasonografii dopplerowskiej nerek, jest używany do oceny hemodynamiki nerek. Celem pracy była ocena zależności między RRI a AAC u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym. Metody: U pacjentów z nadciśnieniem tętniczym wykonano badanie radiologiczne klatki piersiowej oraz ultrasonografię dopplerowską nerek. Podzielono ich na dwie grupy w zależności od RRI (grupa 1: RRI ≥0,70; grupa 2: RRI < 0,70). Dwóch egzaminatorów, zaślepionych na wyniki RRI, dokonało przeglądu AAC u tych pacjentów. Stwierdzono, że wartość kappa wynosi 0,781, a wartość p < 0,001 uznano za istotną. Wyniki: Do badania włączono 289 chorych na nadciśnienie tętnicze (średnia wieku 63,87 ± 11,38 lat). U 53,6% (n = 155) badanych stwierdzono RRI ≥0,70. Pacjenci z RRI ≥70 byli starsi, częściej występowały u nich AAC oraz przerost lewej komory serca. Przeprowadzono analizę wielokrotnej regresji liniowej, aby sprawdzić, czy obecność AAC istotnie predysponuje RRI. Wyniki analizy regresji wskazały, że obecność AAC istotnie prognozowała RRI (β = 0,053; p < 0,001). Wnioski: Stwierdzono silny i niezależny związek między AAC na zdjęciu RTG klatki piersiowej a RRI u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym.

© 2018 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel

Significance of the Study

Wprowadzenie

Nadciśnienie tętnicze jest jednym z najczęstszych czynników ryzyka sercowo-naczyniowego. Rozpoznanie i leczenie uszkodzeń narządów końcowych związanych z nadciśnieniem tętniczym wraz z regulacją ciśnienia tętniczego może przyczynić się do zmniejszenia śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych. Podczas gdy nerki regulują ciśnienie krwi, są one również dotknięte przez wszelkie upośledzenia w regulacji ciśnienia krwi. Nefropatia związana z nadciśnieniem tętniczym jest spowodowana postępującą utratą nefronów z powodu zaburzonej regulacji ciśnienia krwi. Nefropatia nadciśnieniowa zwiększa śmiertelność z przyczyn sercowo-naczyniowych, dodatkowo upośledzając regulację ciśnienia tętniczego. W praktyce klinicznej jednym z najdokładniejszych wskaźników nefropatii nadciśnieniowej, wykrywanej na podstawie wskaźnika filtracji kłębuszkowej (GFR) i mikroalbuminurii, jest wskaźnik oporności nerek (RRI). RRI jest wyliczeniem stosowanym do oceny różnych stanów klinicznych, takich jak przewlekłe odrzucanie przeszczepu nerki, wykrywanie i leczenie zwężenia tętnicy nerkowej, progresja przewlekłej choroby nerek oraz ostra i przewlekła obturacyjna choroba nerek, a jednocześnie odzwierciedla zmiany perfuzji wewnątrznerkowej. RRI odzwierciedla perfuzję wewnątrznerkową i jest ważnym wskaźnikiem systemowych zmian hemodynamicznych. Dlatego ma wartość prognostyczną u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym. Predyktory zwiększonego RRI są potrzebne u pacjentów z nadciśnieniem, aby określić stopień upośledzenia funkcji nerek.

Zwapnienie łuku aorty (AAC) jest spowodowane postępem uszkodzenia śródbłonka, jak również zapaleniem i zwapnieniem w łuku aorty wynikającym z wysokiego ciśnienia krwi. Podobnie jak RRI, AAC jest ważnym wskaźnikiem zwiększonego obciążenia ciśnieniem krwi i zwiększonej sztywności tętnic. AAC może być łatwo wykryta podczas rutynowej radiografii klatki piersiowej, która jest prostym, niedrogim i powszechnie dostępnym narzędziem. Obecnie nie ma dostępnych doniesień na temat wykorzystania AAC w predykcji RRI. Obecne badanie zostało zatem zaprojektowane w celu zbadania związku między AAC a RRI.

Metody

Pacjenci z nadciśnieniem tętniczym, którzy zgłosili się do Szpitala Uniwersyteckiego w Karabük w okresie od stycznia 2016 roku do stycznia 2017 roku, zostali poddani standardowemu badaniu radiologicznemu klatki piersiowej oraz ultrasonografii dopplerowskiej nerek. Dwóch innych lekarzy, którzy nie zostali poinformowani o wynikach RRI, oceniało AAC za pomocą RTG klatki piersiowej. Pacjentów podzielono na dwie grupy w zależności od RRI. Grupę 1 stanowili chorzy z RRI ≥0,70, a grupę 2 chorzy z RRI < 0,70. Z badania wykluczono chorych po zabiegach kardiochirurgicznych, z umiarkowaną lub ciężką wadą zastawkową serca, z migotaniem przedsionków, ze zwężeniem tętnicy nerkowej, z nefrostomią, z chorobą nowotworową, z ostrą/przewlekłą chorobą infekcyjną i zapalną oraz ciężarne. Do obliczenia liczebności próby zastosowano następujący wzór:

gdzie Z = standardowa wariancja normalna przy 5% błędzie typu 1 (p < 0,05; we wzorze użyto 1.96 wykorzystano we wzorze), p = oczekiwana proporcja w populacji na podstawie wcześniejszych badań lub badań pilotażowych, a d = błąd bezwzględny lub precyzja (musi być ustalona przez badacza).

Według badania Berni i wsp , odsetek pacjentów mających RRI ≥0,70 wynosił około 25%. <Błąd precyzji/absolutny utrzymano na poziomie 5%, a błąd typu 1 utrzymano na poziomie 5%. Odpowiednio, stosując te wartości w powyższym wzorze:

Wszystkich pacjentów zbadano pod kątem czynników ryzyka sercowo-naczyniowego. Za chorych na cukrzycę uznano pacjentów, którzy wcześniej otrzymywali doustne leki przeciwcukrzycowe i/lub insulinę, lub tych, u których stężenie glukozy we krwi na czczo wynosiło ≥126 mg/dl co najmniej dwukrotnie. Pacjenci, którzy wcześniej otrzymywali leczenie przeciwnadciśnieniowe lub u których ciśnienie tętnicze krwi wynosiło ≥130/80 mm Hg przy co najmniej dwóch okazjach, zostali uznani za pacjentów z nadciśnieniem tętniczym. Ciśnienie tętna obliczano jako różnicę między szczytowym ciśnieniem skurczowym i rozkurczowym. Pacjentów z cholesterolem całkowitym > 200 mg/dl lub cholesterolem lipoproteinowym o małej gęstości > 100 mg/dl lub tych, którzy w przeszłości otrzymywali leki obniżające poziom lipidów, uznawano za hiperlipidemików. Przewlekła choroba nerek (CKD) została zdefiniowana jako albo uszkodzenie nerek, albo zmniejszony GFR < 60 mL/min/1,73 m2 przez co najmniej 3 miesiące.

Albuminuria jako marker uszkodzenia nerek została zdefiniowana jako szybkość wydalania albuminy z moczem ≥30 mg/24 h . Obliczyliśmy szacowany GFR za pomocą równania Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration . Za palaczy uznano aktywnych palaczy lub tych, którzy rzucili palenie w ciągu ostatniego 1 miesiąca. Wskaźnik masy ciała obliczono dzieląc wagę (kg) przez kwadrat wysokości (m2). Powierzchnia ciała została obliczona jako pierwiastek kwadratowy z iloczynu wagi (kg) i wzrostu (cm) podzielonego przez 3,600 . U wszystkich pacjentów wykonano 12-odprowadzeniowe badanie elektrokardiograficzne oraz przezklatkowe badanie echokardiograficzne. RRI był mierzony za pomocą ultrasonografii dopplerowskiej nerek przez radiologa, który był zaślepiony na informacje o pacjencie. Rutynowe badania biochemiczne przeprowadzono u pacjentów po 12 h postu.

Ocena AAC

Standardowe (tylno-przednie) zdjęcie radiologiczne klatki piersiowej (40 × 40 cm; Curix HT 1.000G Plus, Agfa, Mortsel, Belgia) wykonano u pacjentów w pozycji stojącej (Thoramat, Siemens, Erlangen, Niemcy). Odległość ognisko-pacjent została ustawiona na 150 cm. Zastosowano automatyczną kontrolę ekspozycji o stałym napięciu lampy 117 kV. AAC oceniano w następujący sposób: stopień 0, brak widocznych zwapnień; stopień I, małe plamki zwapnień lub cienkie zwapnienia na gałce aortalnej; stopień II, jeden lub więcej obszarów pogrubionych zwapnień; stopień III, okrągłe zwapnienia na gałce aortalnej (ryc. 1). Dwóch egzaminatorów, którzy byli zaślepieni na wyniki RRI, dokonało przeglądu AAC na radiogramie klatki piersiowej. Sto radiogramów klatki piersiowej, losowo wybranych do oceny AAC, zostało ocenionych niezależnie przez dwóch kardiologów w celu oceny wiarygodności rozpoznania AAC. Stwierdzono, że wartość kappa wynosiła 0,781, a p < 0,001.

Pomiar RRI

Wszystkie badania zostały wykonane przez jednego radiologa przy użyciu tego samego urządzenia (filtr ścienny 50-Hz i przetwornik convex 2- do 5-MHz) (Toshiba, Nemio 35 , Japan Care Co, Ltd., Japonia) po 6 godzinach na czczo i 20 minutach odpoczynku. Za pomocą kolorowej ultrasonografii dopplerowskiej mierzono wartości RRI w segmentalnych tętnicach wewnątrznerkowych. Podczas badania uzyskano widma z poziomu tętnic łukowatych (połączenie korowo-miedniczne) lub tętnic międzypłatowych (przylegających do piramid rdzenia) przy użyciu okna dopplerowskiego o średnicy od 2 do 4 mm. Wszystkie pomiary były wykonywane przy użyciu Dopplera trzymanego pod kątem 30 i 60° do światła naczynia. Fale uzyskiwano przy użyciu najniższej częstotliwości powtarzania impulsów, która nie generowała artefaktów. Stosowano najniższy filtr i najwyższe wzmocnienie, które nie generowałyby szumu tła. U badanych w obecnym badaniu wartości RRI dla części zlepionej określano przy użyciu obu nerek w linii pośrodkowej. Zmierzono trzy wartości RRI i uśredniono je dla obu nerek. Wzór użyty do obliczenia RRI jest następujący: (systolic peak velocity – diastolic peak velocity) / systolic peak velocity . Trzydziestu pacjentów wybrano losowo do oceny zmienności wewnątrzobserwacyjnej; ten sam pomiar powtórzono po 1 h w sposób zaślepiony. Wartości RRI wykazały doskonałą odtwarzalność z wewnątrzobserwacyjnym współczynnikiem intraklasy 0,937 i 95% przedziałem ufności 0,872-0,969.

Pomiary laboratoryjne

Próbki krwi żylnej uzyskano od wszystkich uczestników przy przyjęciu. Kreatynina, azot mocznikowy we krwi, glukoza, cholesterol całkowity, cholesterol lipoproteinowy o małej gęstości, cholesterol lipoproteinowy o dużej gęstości, potas, sód, albumina, wapń, fosforan, aminotransferaza asparaginianowa i aminotransferaza alaninowa były oznaczane ilościowo przy użyciu standardowych technik. Dwudziestoczterogodzinne stężenie albuminy w moczu mierzono metodą immunoturbidymetryczną. U kobiet zbiórkę moczu powtarzano, jeśli pacjentka miesiączkowała. Rutynowe pomiary parametrów chemii krwi i lipidów wykonywano za pomocą analizatora Advia 1800 firmy Siemens.

Badanie echokardiograficzne

Wszystkich pacjentów badano za pomocą komercyjnie dostępnego systemu (Vivid 4; GE Medical Systems, Horten, Norwegia) z przetwornikiem phased-array 3,5-MHz. Konwencjonalne parametry M-mode, B-mode i Doppler mierzono zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Echokardiograficznego. Zmierzono średnicę końcoworozkurczową i końcowoskurczową lewej komory (LV) oraz grubość ściany tylnej i przegrody międzykomorowej. Masę LV obliczano za pomocą równania Devereux: LV mass = 0,8 × + 0,6 g, gdzie LVEDD to średnica końcoworozkurczowa LV, IVST to grubość ściany przegrody międzykomorowej, a PWT to grubość ściany tylnej. Wskaźnik masy LV obliczano, dzieląc masę LV przez powierzchnię ciała. Przerost LV definiowano jako wskaźnik masy LV > 115 g/m2 dla mężczyzn i > 95 g/m2 dla kobiet .

Analizy statystyczne

Do analizy statystycznej danych użyto programu Number Cruncher Statistical System (NCSS) 2007 (Kaysville, UT, USA). Do oceny danych wykorzystano metody statystyki opisowej (średnia, odchylenie standardowe, mediana, częstość, stosunek, minimum, maksimum), przy czym do porównania danych ilościowych zastosowano test t-Studenta przy porównywaniu dwóch grup wartości o rozkładzie normalnym oraz test U Manna-Whitneya dla parametrów o rozkładzie innym niż normalny. Do oceny zależności między zmiennymi wykorzystano analizę korelacji Pearsona i Spearmana. W celu określenia czynników ryzyka wpływających na RRI posłużono się analizą regresji liniowej. Do porównania danych jakościowych zastosowano test χ2 Pearsona. Istotność uznawano przy wartości p < 0,05.

Wyniki

Badaniem objęto 289 pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (67,1% kobiet, 32,9% mężczyzn, średni wiek 63,87 ± 11,38 lat). Stwierdzono, że RRI po stronie prawej wynosi od 0,53 do 0,89, średnio 0,71 ± 0,07, natomiast RRI po stronie lewej wynosi od 0,55 do 0,89, średnio 0,71 ± 0,07. U 46,4% (n = 134) chorych stwierdzono RRI < 0,70, a u 53,6% (n = 155) chorych ≥0,70. Stwierdzono istotną statystycznie różnicę między grupami RRI pod względem średniego wieku, przy czym średnia wieku w grupie z RRI ≥70 była wyższa niż w grupie z RRI < 70 (odpowiednio 67,71 ± 10,13 vs. 59,43 ± 11,15, p = 0,001). W grupie z RRI ≥70 obserwowano większy przerost LV (p = 0,001) oraz częstsze stosowanie kwasu acetylosalicylowego (p = 0,035) (tab. 1). AAC nie wykryto u 30,1% (n = 87) badanych, natomiast wykryto ją u 69,9% (n = 202) chorych jako I stopień u 38,1% (n = 110), II stopień u 24,2% (n = 70) i III stopień u 7,6% (n = 22) chorych. Stwierdzono istotny statystycznie związek między RRI a obecnością i stopniem zaawansowania AAC (p = 0,001) (tab. 2).

W sumie 156 spośród 289 pacjentów (54,0%) miało CKD. Pacjentów podzielono na dwie grupy w zależności od obecności CKD. Pacjenci z CKD byli starsi (65,22 ± 11,96 vs. 62,29 ± 10,46 lat; p = 0,028). Stwierdzono większą częstość palenia tytoniu (41 vs. 22 ; p = 0,046) i przerostu LV (53 vs. 30 ; p = 0,032) u chorych z CKD. Ponadto u pacjentów z CKD stwierdzono wyższe wartości RRI (0,71 vs. 0,70,0 ; p = 0,045) oraz częstość występowania AAC (118 vs. 84 ; p = 0,021).

RRI wykazywał ujemną korelację z GFR (r = -0.267; p < 0,01), stężeniem albumin w surowicy (r = -0,189; p < 0,01), powierzchnią ciała (r = -0,120; p < 0,05) i frakcją wyrzutową LV (r = -0,188; p < 0,01), co było istotne statystycznie. Stwierdzono natomiast dodatnią korelację między mocznikiem (r = 0,242; p < 0,01), stężeniem potasu w surowicy (r = 0,140; p < 0,05), albuminurią (r = 0.187; p < 0,05), średnica końcoworozkurczowa LV (r = 0,207; p < 0,01), średnica końcowoskurczowa LV (r = 0,227; p < 0,01), średnica lewego przedsionka (r = 0,126; p < 0.05), grubość przegrody międzykomorowej (r = 0,215; p < 0,01), grubość ściany tylnej (r = 0,136; p < 0,05), wskaźnik masy LV (r = 0,320; p < 0.01), ciśnienia tętna (r = 0,211; p < 0,05) i skurczowego ciśnienia tętniczego (r = 0,146; p < 0,05), co było istotne statystycznie (tab. 3).

Liniowa analiza regresji

Występowanie AAC, ciśnienie tętna, albuminuria, wiek, GFR, poziom albuminy w surowicy, Frakcja wyrzutowa LV, średnica lewego przedsionka, poziom potasu w surowicy, prędkość A, wskaźnik masy LV, powierzchnia ciała, prawidłowa geometria, przerost koncentryczny, przerost ekscentryczny i stosowanie kwasu acetylosalicylowego były analizowane za pomocą analizy regresji liniowej.

W celu sprawdzenia, czy obecność AAC istotnie prognozuje RRI, przeprowadzono wielokrotną analizę regresji liniowej. Wyniki regresji wskazały, że model wyjaśniał 39,2% wariancji oraz że model był istotnym predyktorem RRI (F(16,72) = 10,964; p < 0,001). Stwierdzono, że obecność AAC istotnie przewidywała RRI (β = 0,053; p < 0,001) (Tabela 4).

Dyskusja

W badaniu tym ustalono silny i niezależny związek między AAC, ocenianym w badaniu radiologicznym klatki piersiowej, a RRI, wskaźnikiem wewnątrznerkowego parametru hemodynamicznego.

Nadciśnienie tętnicze powoduje remodeling, dysfunkcję śródbłonka, zwłóknienie i zwapnienie, co prowadzi do istotnych zmian naczyniowych. Zwapnienie naczyń jest jednym z najważniejszych wskaźników uszkodzenia naczyń związanych z nadciśnieniem tętniczym. Zapalenie, stres oksydacyjny, zaawansowany wiek i układ renina-angiotensyna są ważnymi czynnikami zaangażowanymi w rozwój zwapnienia naczyń. Angiotensyna 2, substrat układu renina-angiotensyna, odgrywa aktywną rolę we wzroście i różnicowaniu się komórek mięśni gładkich naczyń. Komórki mięśni gładkich naczyń są zbudowane z komórek mezenchymalnych, takich jak osteoblasty. Pod wpływem różnych czynników środowiskowych komórki mięśni gładkich naczyń przekształcają się w fenotyp osteoblastów i produkują wapń. W ten sposób zwapnienie naczynia rozpoczyna się od produkcji wapnia w intimie lub medium. AAC jest prototypem zwapnienia naczyniowego. Najważniejszym patofizjologicznym uzasadnieniem związku między AAC i RRI jest fakt, że tworzenie się AAC powoduje zmniejszenie podatności naczynia i zwiększenie sztywności tętnic. Zwiększona sztywność tętnic zmniejsza ich podatność. Podatność tętnic jest główną cechą składowej pulsacyjnej ciśnienia tętniczego. Elastyczna ściana aorty rozciąga się podczas skurczu i zwija podczas rozkurczu. Dzięki temu zapewniony jest przepływ krwi obwodowej, a zwłaszcza nerkowej. Zwiększona sztywność aorty zmniejsza jej podatność, co prowadzi do zmniejszenia nerkowego przepływu krwi. Zmniejszenie nerkowego przepływu krwi prowadzi do wzrostu RRI.

Wapnienie naczyń jest jednostką ogólnoustrojową, która wpływa na całe łożysko naczyniowe. W innym badaniu stwierdzono silną i niezależną korelację pomiędzy zwapnieniem tętnic wieńcowych a AAC. Ponadto wykazano silną korelację między AAC a zwapnieniem tętnic nerkowych, które jest ważnym wskaźnikiem choroby tętnic nerkowych. Zwapnienie tętnic nerkowych ma istotny wpływ na parametry hemodynamiczne nerek. Według autorów innym patofizjologicznym wyjaśnieniem korelacji między AAC a RRI jest fakt, że systemowe zwapnienia naczyń, a zwłaszcza zwapnienia tętnic nerkowych, upośledzają nerkowy przepływ krwi, zwiększając tym samym RRI. Obecne badanie wykazało związek między AAC a RRI, oferując tym samym solidniejsze dowody na związek między zwapnieniem naczyń a RRI. Obecne badanie wykazało również korelację pomiędzy wiekiem a wzrostem RRI. Wiele doniesień wskazuje na istnienie korelacji między RRI a wiekiem. Sugerowano, że powodem wzrostu RRI wraz z wiekiem jest zwiększona sztywność tętnic i zmniejszona podatność naczyń wraz z wiekiem. W niniejszym badaniu stwierdzono również silną odwrotną korelację pomiędzy GFR a RRI. W piśmiennictwie opisano kilka badań wykazujących korelację między RRI i GFR, które potwierdzają wyniki niniejszego badania. W prezentowanym badaniu stwierdzono dodatnią korelację między rozstrzenią LV, funkcją LV a RRI. Ratto i wsp. również wykazali korelację między rozstrzenią LV, funkcją i RRI. Hipertrofia LV (przerost ekscentryczny i koncentryczny) okazała się niezależnym predyktorem RRI w niniejszym badaniu. Wzrost sztywności tętnic i obciążenia ciśnieniem tętniczym może zwiększać RRI i prowadzić do rozwoju przerostu LV. Alterini i wsp. wykazali korelację wskaźnika masy LV i przerostu LV z RRI u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym, co jest zgodne z wynikami prezentowanego badania.

RRI jest wynikiem interakcji pomiędzy parametrami hemodynamicznymi nerek a ogólnoustrojowymi czynnikami hemodynamicznymi. Wykazano, że RRI wiąże się z wieloma chorobami nerek, jak również z ważnymi chorobami układu sercowo-naczyniowego. RRI, który jest ściśle związany z funkcją skurczową i rozkurczową LV, wskazuje na progresję choroby nerek, jak również na progresję niewydolności serca. Podobnie, wiadomo, że RRI jest ściśle związane ze sztywnością aorty i miażdżycą. Ciśnienie tętna powstaje w wyniku interakcji funkcji serca ze strukturami naczyniowymi. Wykazano silny związek między RRI a ciśnieniem tętna. W niniejszej pracy wykazano również istotny związek między RRI, ciśnieniem tętna i albuminurią. Nie udało się natomiast wykazać istotnego związku między RRI, E/A i frakcją wyrzutową LV.

Zespół sercowo-nerkowy jest przykładem wzajemnego powiązania chorób serca i nerek. W zespole tym obserwuje się zwiększoną zachorowalność i śmiertelność z przyczyn sercowo-naczyniowych. W prezentowanym badaniu stwierdzono również korelację pomiędzy poszerzeniem LV, funkcjami i RRI, co potwierdza możliwość wystąpienia zespołu sercowo-nerkowego. Ponadto stwierdzono, że zwapnienie aorty jest niezależnym i silnym czynnikiem predykcyjnym RRI. Wiadomo również, że funkcja i przerost LV są skorelowane ze zwapnieniem aorty. Można spekulować, że zwapnienie naczyń krwionośnych może być zaangażowane w patogenezę zespołu sercowo-nerkowego, co potwierdzają wyniki niniejszego badania. Ponadto, jasne jest, że zwapnienie aorty może być częścią zespołu sercowo-nerkowego.

Ograniczenia

Ograniczenia tego badania obejmują małą liczebność próby, badanie prowadzone w jednym ośrodku, brak wykazania patofizjologicznej zależności między RRI i AAC oraz brak badania uszkodzenia narządów końcowych wynikającego z nadciśnienia tętniczego.

Wniosek

Ustalono, że u chorych z nadciśnieniem tętniczym występuje niezależna i silna korelacja między AAC a RRI, wskaźnikiem parametrów hemodynamicznych nerek. AAC, oceniana w badaniu radiologicznym klatki piersiowej i będąca powszechnie stosowaną i łatwo dostępną procedurą w praktyce klinicznej, może być wskaźnikiem zwiększonego RRI.

Oświadczenie etyczne

Badanie zaplanowano zgodnie z zaleceniami Deklaracji Helsińskiej w sprawie badań biomedycznych z udziałem ludzi. Instytucjonalna Komisja Etyczna zatwierdziła protokół badania; od każdego uczestnika uzyskano świadomą zgodę.

Oświadczenie o jawności

Autorzy nie mają konfliktu interesów do zgłoszenia.