TEXT
Człowiecze wirusy grypy zwykle zakażają górne drogi oddechowe, powodując kichanie, katar i kaszel, a także gorączkę, złe samopoczucie i bóle stawów (22). Ponadto zgłaszano również powikłania neurologiczne w przypadku wprowadzenia nowego podtypu wirusa grypy do populacji ludzkiej, czego przykładem są pandemie hiszpańska (1918 r.) i azjatycka (1957 r.) (2-4, 6, 10, 18, 22).
W 1997 r. wirus grypy H5N1, który pochodzi od drobiu, wywołał epidemię u ludzi. Od tego czasu na całym świecie ponad 500 osób zostało zakażonych wirusami H5N1, a śmiertelność wynosiła około 60% (21). Zakażenie wirusem H5N1 u ludzi objawia się zazwyczaj ciężkim zapaleniem płuc, które przechodzi w zespół ostrej niewydolności oddechowej; jednakże u niektórych ofiar wirusa H5N1 wystąpiły objawy neurologiczne (1). RNA i antygeny wirusa H5N1 zostały wykryte w mózgach pacjentów, a sam wirus został wyizolowany z płynu mózgowo-rdzeniowego (5, 7) Dane te sugerują, że niektóre wirusy H5N1 mogą powodować zapalenie mózgu u ludzi, jak to miało miejsce we wczesnych fazach pandemii hiszpańskiej i azjatyckiej.
Fretki stanowią przydatny model ssaków do badania zakażenia grypą, ponieważ są bardzo podatne na zakażenie wirusami grypy i rozwijają niektóre z objawów grypy występujących u ludzi (8, 12, 14, 16, 19). Neuroinwazyjność wirusa grypy H5N1 po ekspozycji donosowej została również opisana w modelu fretki (23). Dlatego, aby zbadać długoterminowe neurologiczne skutki zakażenia wirusem H5N1, zakażaliśmy fretki wirusami H5N1, które wywołują łagodne objawy u tych zwierząt i obserwowaliśmy wpływ na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) przez 9 miesięcy. Staraliśmy się również wyjaśnić drogę, za pomocą której te wirusy H5N1 wnikają do OUN.
Sześciomiesięczne fretki zostały inokulowane donosowo 106 PFU wirusa A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) lub A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486). Wirusy te namnażano w komórkach Madin-Darby canine kidney (MDCK) w minimalnym podłożu podstawowym uzupełnionym 0,3% surowiczą albuminą bydlęcą. W dniach 3, 6 i 12 oraz w miesiącach 1, 3, 6 i 9 po zakażeniu (p.i.), pobraliśmy próbki tkanek do izolacji wirusa i badania patologicznego. Fretki były ospałe i wykazywały oznaki i objawy infekcji układu oddechowego w ciągu pierwszych 10 dni p.i., ale nie wykazywały znaczących objawów neurologicznych, co jest sprzeczne z wynikami podanymi wcześniej (23). Próbki tkanek z turbinek nosowych, płuc, tchawicy, mózgu, wątroby, śledziony, nerek, serca, trzustki i rdzenia kręgowego zostały pobrane i zhomogenizowane do 10% zawiesiny w buforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej. Miano wirusa w każdej tkance określano za pomocą testów płytkowych. Wirusy replikowały się głównie w turbinach nosa, z mianem wirusa osiągającym 105 do 106 PFU/gram tkanki po 3 do 6 dniach p.i. (Tabela 1). Tkanki mózgowe pobrane od fretek zakażonych HK483 lub HK486 zostały zakonserwowane w 10% obojętnej, zbuforowanej formalinie i przygotowane do zatopienia w parafinie. Tkanki pocięto na plastry o grubości 5 mm i zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E). Dodatkowe wycinki wycinano do barwienia immunohistologicznego króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciwko wirusowi grypy H5. Badanie histologiczne ujawniło inwazję lub uszkodzenie neuronów, w tym zapalenie splotu naczyniówkowego (Tabela 2). Fretki zakażone wirusem HK486 wykazywały oznaki zapalenia nonsuppuratywnego (Rys. 1a) i ekspresję antygenów wirusowych (Rys. 1b), które utrzymywały się przez 12 dni; antygeny wirusowe nie były wykrywane w 1 miesiącu p.i. Nonsuppuratywne zapalenie mózgu trwało przez 3 miesiące (Rys. 1c), z resztkową blizną glejową widoczną w 6 i 9 miesiącu p.i. w obszarach, w których antygeny wirusowe były wykrywane we wcześniejszej fazie (Rys. 1d). Ponadto, fretki zakażone HK486 wykazywały makroskopowe uszkodzenie układu węchowego w 12 dniu p.i. (Rys. 1e i f). Wyniki te sugerują, że podczas gdy wysoce patogenne wirusy H5N1 wpływają głównie na drogi oddechowe gospodarza (1), mogą one również powodować powikłania neurologiczne. W przeciwieństwie do wirusa HK486, który wniknął do miąższu mózgu fretek i spowodował poważne uszkodzenia miąższu, drugi szczep H5N1, HK483, spowodował ciężkie bezzastoinowe zapalenie naczyń bez widocznych uszkodzeń miąższu mózgu fretek w 6 dniu p.i. Chociaż antygen wirusowy nie mógł być wykryty w obrębie naczyń, uszkodzenie naczyń było ewidentne, co charakteryzowało się obrzękiem śródbłonka (Rys. 2a, groty strzałek), rozproszonymi komórkami apoptotycznymi (Rys. 2b, groty strzałek) oraz śródściennym naciekiem makrofagów (Rys. 2a, strzałki) i leukocytów wielojądrzastych (Rys. 2b, strzałka). Zmiany naczyniowe występowały we wzgórzu, na styku istoty szarej i białej oraz w pniu mózgu. W preparatach mózgów badanych po 1 i 6 miesiącach p.i. stwierdzono zmiany krwotoczne świadczące o przewlekłym i powtarzającym się krwotoku okołonaczyniowym (ryc. 2c) we wzgórzu, móżdżku i przestrzeni podpajęczynówkowej przedniej części mózgu (ryc. 2d). Obserwacje te są zgodne z doniesieniami o powikłaniach krwotocznych mózgu wywołanych wirusem grypy w czasie corocznych epidemii (11). Zapalenie naczyń mózgowych wtórne do infekcji wirusowej jest stosunkowo częste (17) i prawdopodobnie jest przyczyną kruchości ściany naczyniowej, prowadzącej do krwotoku mózgowego. Wydaje się zatem uzasadnione stwierdzenie, że zakażenie wirusem H5N1 u ludzi może powodować krwotok do mózgu podobny do tego, jaki obserwuje się przy zakażeniu innymi wirusami neurotropowymi.
- View inline
- View popup
Odzyskiwanie wirusa z tkanek fretek zakażonych wirusem HK483 lub HK486 H5N1
- View inline
- View popup
Prevalence of brain lesions in ferrets at various time points postinfection with highly pathogenic H5N1 influenza virusesa
Zmiany w mózgu u fretek zakażonych wirusem HK486. (a) Ciężkie bezodpływowe zapalenie mózgu w okolicy węchowej w 6. dniu po zakażeniu (p.i.). (b) Ekspresja antygenu wirusa w zmianie w mózgu w 12 dniu po zakażeniu. Komórki neuronalne i glejowe są wybarwione surowicą odpornościową przeciwko wirusowi H5. (Inset) Niezakażone neurony i glej. (c) Tlące się zapalenie mózgu w tkance mózgowej w 3 miesiącu p.i. (d) Okołonaczyniowe tworzenie się blizny glejowej w 9 miesiącu p.i. (e) Makroskopowo widoczna zmiana w mózgu w części układu węchowego (płat piramidowy) w 12 dniu p.i. (f) Częściowa utrata bańki węchowej (górna część mózgu) spowodowana wirusowym zapaleniem mózgu w 1 miesiącu p.i. Porównaj te obrazy z mózgiem pochodzącym z dopasowanej wiekowo kontroli (dolna część mózgu).
Uszkodzenia mózgu u fretek zakażonych wirusem HK483. (a) Wyraźne bezzasiłkowe zapalenie naczyń w 6. dniu p.i. Należy zwrócić uwagę na silny obrzęk komórki śródbłonka naczyniowego (groty strzałek) i migrację makrofagów do ściany naczyniowej (strzałki), w porównaniu z normalnym wyglądem otaczającego miąższu mózgu. (b) Rozproszone komórki apoptotyczne (groty strzałek) i leukocyty wielojądrowe (strzałka) w ścianie naczyniowej w 6. dniu p.i. (c) Stare i świeże zmiany krwotoczne we wzgórzu u fretki, która została poddana sekcji zwłok w 6. miesiącu p.i. (groty strzałek, makrofagi pełne hemosyderyny w starej zmianie; strzałki, świeży krwotok z czerwonymi krwinkami). (d) Świeży krwotok podpajęczynówkowy w mózgu fretki w 6 miesiącu p.i. Zwraca uwagę nagromadzenie czerwonych krwinek pomiędzy leptomeninges (przerywana czarna linia) i arachnoid mater (przerywana czerwona linia).
Aby zbadać drogę, za pomocą której wirusy H5N1 wnikają do mózgów fretek, przeanalizowaliśmy rozmieszczenie zmian w mózgu i ekspresję antygenów wirusowych obserwowanych u fretek zakażonych wirusami HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) i A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18). Wirusy HK213, VN1204 i NCVD18 były namnażane w komórkach MDCK w minimalnym podłożu podstawowym uzupełnionym 0,3% surowiczą albuminą bydlęcą. Sześciomiesięcznym fretkom inokulowano donosowo 106 PFU wirusa. Tkanki mózgowe pobierano w fazie ostrej, w 3 i 6 dniu po zakażeniu w przypadku VN1204 i NCVD18 oraz dodatkowo w 12 dniu po zakażeniu w przypadku HK213. Tkanki poddano barwieniu metodą H&E i immunohistochemii w celu wykonania badania histologicznego. Zmiany w miąższu mózgu wywołane przez VN1204, NCVD18 i HK213 charakteryzowały się beznadżerkowym zapaleniem mózgu, a wzór ekspresji antygenów wirusowych był zasadniczo taki sam jak w przypadku HK486 (dane nie pokazane). Aby zrozumieć trójwymiarowe (3D) rozmieszczenie zmian w mózgu i antygenów wirusowych, wykreśliliśmy je za pomocą obrazowania 3D (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japonia) mózgu mangusty żółtej (Cynictis penicillata), którego architektura jest bardzo podobna do mózgu fretki (20). Aby uwidocznić drogę węchową (tj. drogę czuciową dla zmysłu węchu), zaznaczyliśmy na obrazach 3D ścieżki nerwowe z opuszki węchowej do kory piriform jako ramę odniesienia (Ryc. 3a, kolor żółty; patrz również Movie S1 w materiale uzupełniającym). Znaleźliśmy trzy różne wzory zmian w mózgu, z i bez antygenów wirusowych, spowodowane przez różne wirusy grypy H5N1: te rozmieszczone tylko wzdłuż drogi węchowej (ryc. 3b i c, przerywana żółta linia; patrz także filmy S2 i S3) (HK213 i NCVD18); te wykryte wzdłuż drogi węchowej (ryc. 3d i e, przerywana żółta linia; patrz również Filmy S4 i S5) i w pniu mózgu (Rys. 3d i e, białe strzałki; patrz również Filmy S4 i S5) (HK486 i VN1204); oraz te w innych obszarach (Rys. 3f; patrz również Film S6) (HK483). Podstawa do oddzielenia trzeciej grupy zmian od pozostałych dwóch grup jest bardziej widoczna, gdy rozkłady zmian są badane od tyłu (Ryc. 3g i h, żółty versus niebieski versus czerwony). Te wyniki mapowania wskazują, że większość badanych przez nas szczepów H5N1 wnikała do mózgu drogą węchową (ryc. 3, przerywana żółta linia). Jednym wyjątkiem był szczep HK483 (ryc. 3f), który wyraźnie celował w naczynia mózgowe u fretek, powodując zmiany poza układem węchowym.
Rozmieszczenie zmian w mózgu po zakażeniu szczepem HK483, HK486, HK213, NCVD18 lub VN1204 wirusa H5N1. Zmiany w mózgu są odwzorowane na trójwymiarowych obrazach mózgu mangusty żółtej. Analizie poddano wybrane fragmenty mózgu, dlatego też wykresy lokalizacji zmian są nieciągłe. (a) Droga węchowa (żółta). Rozmieszczenie zmian i antygenów wirusowych (kolor czerwony) związanych z zakażeniem HK213 (b) lub NCVD18 (c) następuje drogą węchową (żółta przerywana linia). U zwierząt zakażonych HK486 (d) lub VN1204 (e) zmiany i antygeny wirusowe zlokalizowane są w pniu mózgu (białe strzałki) oraz na drodze węchowej (czerwone plamki w obrębie przerywanej żółtej linii). Szczep HK483 (f) spowodował poważne uszkodzenie naczyń krwionośnych, z widocznymi zmianami krwotocznymi (niebieskie plamy). (g) Widok od tyłu na drogę węchową (żółte plamy). (h) Widok z tyłu na zmiany krwotoczne wywołane przez HK483 (niebieskie) i zapalenie naczyń krwionośnych (czerwone) poza drogą węchową. Panele od a do f są widokami brzusznymi.
Zanim wirusy H5N1 mogą stać się pandemiczne, prawdopodobnie będą musiały nabyć zdolność do dobrego wzrostu w górnej części ludzkich dróg oddechowych, co doprowadziłoby do skutecznego przenoszenia z człowieka na człowieka poprzez kichanie i kaszel (13, 22). Nasze dane od fretek sugerują, że jeśli wysoce patogenne wirusy H5N1 zdobędą takie oparcie u ludzi, mogą powodować subkliniczne powikłania neurologiczne poprzez inwazję do mózgu drogami nerwowymi lub poprzez wywoływanie zapalenia naczyń krwionośnych mózgu. Wcześniej wirus H3N2 został wykryty w mózgach fretek; jednak ilość wirusa w mózgach była niska (mniej niż 102,2 log10 50% dawek zakaźnych jaj) i nie odnotowano dowodów na obecność antygenów wirusa w mózgu (23). Stwierdziliśmy, że wirus pandemiczny H1N1 z 2009 r. replikował się skuteczniej w drogach oddechowych fretek niż ludzki sezonowy wirus H1N1 (9, 13, 15) i powodował zmiany w opuszce węchowej bez objawów; jednak nie znaleźliśmy wirusa w miąższu mózgu tych zwierząt (dane nie pokazane). Dlatego inwazja miąższu mózgu, jak wykazano przez obecność antygenów wirusowych, jest charakterystyczna dla wirusów H5N1. Byłoby zatem celowe przeprowadzenie retrospektywnych i prospektywnych badań pod kątem subklinicznych powikłań neurologicznych u pacjentów zakażonych wirusem H5N1. Nasze wyniki budzą obawy, że subkliniczne powikłania neurologiczne mogą towarzyszyć ciężkim zakażeniom układu oddechowego po rozprzestrzenieniu się wirusów H5N1 na całym świecie.