The sea urchin animal pole domain is a Six3-dependent neurogenic patterning center | Development

RESULTS

Identification of candidate animal pole domain (APD) regulatorygenes

Aby określić wczesny stan regulacyjny APD w zarodku jeżowca, zastosowaliśmy jednocześnie podejście bioinformatyczne i eksperymentalne w celu identyfikacji genów kodujących białka regulacyjne, które ulegają ekspresji w thisterritory przed gastrulacją. Podejście bioinformatyczne wykorzystało wysiłki naszego laboratorium (Burke i in., 2006) i innych (Howard-Ashby i in., 2006a; Howard-Ashby i in., 2006b; Materna i in., 2006; Tu i in., 2006) w zakresie anotacji sekwencji genomu, które udokumentowały wzorce ekspresji w APD wielu genów kodujących czynniki transkrypcyjne i/lub będących ortologami czynników, o których wiadomo, że funkcjonują w tkance nerwowej zarodków innych gatunków. W podejściu eksperymentalnym porównywano reprezentację RNA w zarodkach, którym wstrzyknięto mRNA Δkadheryny, z normalnymi zarodkami w stadium wylęgania blastuli. Zarodki pozbawione jądrowejβ-kateniny składają się prawie wyłącznie z ektodermy bieguna zwierzęcego, co wykazano na podstawie wzorców ekspresji foxq2 i hbn. W normalnych zarodkach, te mRNA są ograniczone do bieguna zwierzęcego na początku stadium blastuli (Burke i in., 2006; Tu i in., 2006; Yaguchi i in., 2008), a obszary ich ekspresji na etapie mezenchymy blastuli nakładają się na biegun zwierzęcy (Fig. 1B-D). W miarę rozwoju przez gastrulację, domena komórek wykazujących ekspresję hbn tworzy pierścień otaczający komórki wykazujące ekspresję foxq2 (ryc. 1F). Kiedy kanoniczna sygnalizacja Wnt, Nodal i BMP zostaje wyeliminowana przez wstrzyknięcie ΔcadherinmRNA, zwierzęca połowa zarodka wykazuje ekspresję foxq2, podczas gdy większość pozostałej części zarodka wykazuje ekspresję hbn (Fig. 1H). Wzorce te wskazują, że zarodki pozbawione kanonicznej sygnalizacji Wnt i Nodal-BMP2/4 składają się prawie w całości z dramatycznie rozszerzonego APD, którego zewnętrzne granice są definiowane przez ekspresję hbn. Transkrypty Foxq2 i hbnt pojawiają się w APD podczas późnych stadiów cleavage/wczesnych blastuli, wskazując, że specyfikacja APD zachodzi przynajmniej do tego czasu.

Aby zidentyfikować wczesne geny regulacyjne APD, porównaliśmy względne stężenia poszczególnych mRNA w Δcadherin mRNA- versus glicerol-injected embryos at the hatching blastula stage using a microarrepresenting all gene predictions found in the sea urchin genome sequence(Wei et al., 2006). Etap ten wyznacza przejście między rozszczepieniem a początkiem morfogenezy i następuje krótko po czasie, w którym wykryto najwcześniejsze markery APD (Burke i in., 2006; Howard-Ashby i in., 2006a; Howard-Ashby i in., 2006b; Tu i in., 2006; Yaguchi i in., 2008). Zidentyfikowano zestaw genów kodujących czynniki transkrypcyjne i komponenty szlaków sygnałowych o średnio co najmniej 3-krotnie wyższej ekspresji w dwóch partiach zarodków, którym wstrzyknięto mRNAΔcadheryny. Geny te częściowo pokrywały się z zestawem genów kandydujących zidentyfikowanych metodą bioinformatyczną. Połączone zestawy zawierają 27 genów i stanowią tymczasowy zestaw genów regulacyjnych wczesnego APD (E-APD)(Tabela 1).

W celu identyfikacji najwcześniej wyrażonych genów w zestawie E-APD, przeanalizowaliśmy wygenerowane przez mikromacierze czasowe profile ekspresji, jak opisano wcześniej (Wei i in., Wzorce zostały zweryfikowane przez porównanie z opublikowanymi danymi (Burke i in., 2006;Croce i in., 2006;Howard-Ashby i in., 2006a;Howard-Ashby i in., 2006b;Materna i in., 2006;Sweet i in., 2002;Takacs i in., 2004;Tu i in., 2006;Yaguchi i in., 2008) oraz przez nasze hybrydyzacje in situ w całych komórkach (nasze niepublikowane obserwacje). Geny zostały podzielone na trzy grupy: te, które były maksymalnie reprezentowane w populacji RNA ojcowskiego (Ryc. 2A), te, które były silnie podkręcone podczas stadiów rozszczepienia (Ryc. 2B,C) oraz te, które były podkręcone pomiędzy późnym rozszczepieniem a wczesnym stadium gastruli (Ryc. 2D). W pierwszej kolejności skupiliśmy się na członkach grupy ekspresji wczesno embrionalnej. Jak pokazano poniżej, używając zarówno testów utraty, jak i wzmocnienia funkcji, zidentyfikowaliśmy jeden z nich, Sp-Six3 (dalej Six3), który działa na szczycie lub blisko szczytu hierarchii regulacyjnej APD.

Six3 ulega ekspresji we wczesnym okresie APD

Identyfikacja Six3 jeżowca jest jednoznaczna, ponieważ jego sekwencja jest bardzo wysoko konserwowana w homeodomenie (98% identyczna zHsSix3), domenie szóstej (91%) i domenie interakcji groucho (71%) (patrzFig. S1 w materiale dodatkowym). Potwierdziliśmy wcześniejsze badania pokazujące, że Six3 ulega ekspresji w dynamicznym wzorcu podczas rozwoju Paracentrotus lividus (Poustka etal., 2007), gatunku blisko spokrewnionego ze Strongylocentrotuspurpuratus użytym w tym badaniu. Najważniejsze cechy to ekspresja transkryptów Six3 w półkuli zwierzęcej podczas późnego wylęgania (ryc. 3A), w APD w stadium wyklutej blastuli (ryc. 3B), a następnie w dwóch pierścieniach (ryc. 3G,H), jednym w pobliżu peryferii APD (ryc. 3C-F,H) i drugim w endomezodermie (ryc. 3C-G), w stadium blastuli mezenchymy. Podczas gastrulacji Six3 wykazuje ekspresję w niektórych komórkach mezenchymy wtórnej rozproszonych w blastocelu i na końcu archenteronu (ryc. 3I, strzałka), jak podają Howard-Ashby i in. (Howard-Ashby i in., 2006b), w komórkach bieguna zwierzęcego (ryc. 3I, J) i ektodermy jamy ustnej (ryc. 3J, K). W stadium pluteus, Six3 RNA jest wykrywane w dwóch skupiskach komórek flankujących jamę ustną (Ryc. 3K, strzałki) oraz w pasie okładzinowym (Ryc. 3K).

Całkowity poziom Six mRNA we wczesnej mezenchymie w stadium blastuli nie zmienia się istotnie po wstrzyknięciu mRNA Δkadheryny (Tabela 1). Hybrydyzacje in situ są zgodne z tym wynikiem i pokazują, że dystrybucja różni się w zarodkach, którym wstrzyknięto mRNA Δkadheryny, nieobecna w komórkach wegetatywnych i zachowująca szeroką ekspresję w półkulach zwierzęcych, która jest ustalona przed ograniczeniem przez procesy zależne od kanonicznego Wnt (patrz Fig. S2 w materiale dodatkowym).

Funkcja Six3 jest wymagana do tworzenia APD i różnicowania neuronów

Aby sprawdzić funkcję Six3, wstrzyknęliśmy do zapłodnionych jaj dwie różne morfoliny blokujące translację Six3, z których każda wywołała takie same defekty rozwojowe. Zarodki w 3 dniu przybierały morfologię zaokrągloną (Ryc. 4A, B), a spikule były zredukowane lub nieobecne. Ektodermie bieguna zwierzęcego brakowało pogrubionej morfologii nabłonka charakterystycznej dla blaszki zwierzęcej (ryc. 4, porównaj A,B z C,nawiasami). W niektórych partiach zarodków gastrulacja przebiegała normalnie, chociaż była opóźniona, a pozycja archenteronu wskazywała, że biegunowość oralna/aboralna została ustalona (ryc. 4A). W innych partiach większość zarodków uległa egzogastrulacji. U zarodków pozbawionych Six3 różnicowanie neuronalne było silnie zahamowane, co wykazano na podstawie barwienia immunologicznego markerów neuronalnych ulegających ekspresji w stadiach lategastrula i pluteus (ryc. 4, porównaj A,B z C). Większość (2/3) zarodków zawierała neurony noserotoninergiczne, a pozostałe miały zredukowaną liczbę (Ryc. 4D) w porównaniu z normalną liczbą na tym etapie (3-5). To samo dotyczyło wszystkich innych neuronów, ocenianych za pomocą markera synaptotagminy (1e11) (Ryc. 4A,B), które występują w APD i paśmie rzęskowym normalnych 3-dniowych zarodków (Ryc. 4C). Co znamienne, ekspresja hbn została zredukowana do poziomu niewykrywalnego metodą hybrydyzacji in situ (ryc. 4F w porównaniu z ryc. 4E). Pomiary QPCR potwierdziły tę obserwację i wykazały, że poziomy mRNA hbn i foxq2, które wyznaczają odpowiednio zewnętrzne i wewnętrzne granice APD, zostały zredukowane 8- do 10-krotnie u morfantów Six3 na etapie blastuli tematycznej (Rys.5).

Six3 jest wymagany do ekspresji większości genów w zestawie E-APD

Uderzający fenotyp spowodowany utratą Six3, jak również jego wczesna ekspresja w zarodku, sugerowały, że może on funkcjonować w pobliżu szczytu sieci regulacyjnej genówAPD. Aby dokładniej zbadać tę możliwość, użyliśmy analizy mikromacierzy do poszukiwania genów zależnych od Six3 w 27 godzinie, kiedy to geny w zestawie E-APD zbliżają się do maksymalnego poziomu ekspresji. Aby wyeliminować endomezodermalne funkcje Six3, przeprowadziliśmy ten screen w embrionach z wstrzykniętąΔkadheryną. Jak pokazano na Rys. 5A, utrata Six3 w tych embrionach całkowicie wyeliminowała rozwój wszystkich nadmiarowych neuronów znalezionych w embrionach wstrzykniętych Δkadheryną i nie utworzył się żaden pogrubiony nabłonek, ponownie demonstrując ważną rolę Six3 w rozwoju APD. Dane mikromacierzowe zidentyfikowały zaskakująco dużą liczbę predyktorów genów (682), które były silnie zdekrementowane (co najmniej 4-krotnie) w embrionach z podwójną iniekcją mRNAΔkadheryny i Six3-MO, w porównaniu z embrionami z samą iniekcją mRNAΔkadheryny. Co więcej, ponad 60% wszystkich genów z poprzedniej mikromacierzy, które ulegały co najmniej 3-krotnej ekspresji w zarodkach, którym wstrzyknięto mRNAΔkadheryny, a zatem prawdopodobnie ulegały ekspresji w APD, ulegało znaczącej redukcji w wyniku utraty Six3. Co ważne, dane mikromacierzy wskazują, że większość genów E-APD była wrażliwa na Six3 (Rys. 5B, kolor żółty). W zgodzie z tym, pomiary QPCR w dwóch innych partiach zarodków wykazały, że tylko 5 genów E-APD nie zależało znacząco od Six3 (Rys. 5B, czerwony, niebieski).

Nadekspresja Six3 jest wystarczająca do rozszerzenia APD

Wyniki te silnie wspierają ideę, że Six3 funkcjonuje wcześnie w sieci regulacyjnej genów APD i podnoszą możliwość, że może być niewystarczająca do indukowania innych komórek w zarodku do przyjęcia losów APD.Misexpression of Six3 resulted in embryos displaying an extraordinary changein morphology. Pasmo gęsto upakowanych komórek w kształcie podkowy rozciągało się w kierunku wegetatywnym od bieguna zwierzęcego (ryc. 6, porównaj B, C z A). Neurony serotoninergiczne, normalnie ograniczone do blaszki zwierzęcej (ryc. 6D), zwiększyły swoją liczebność 4-krotnie i były rozmieszczone wzdłuż gęstego pasma (ryc. 6G). Ponadto, kolumnowe kształty i rozmieszczenie projekcji neuronalnych w komórkach zawierających synaptotagminę (1e11) są podobne do tych w płytce zwierzęcej zarodków kontrolnych (Ryc. 6E, biała przerywana ramka w porównaniu z Ryc. 6H). Wszystkie te komórki zawierają w swoich jądrach NK2.1 (Ryc. 6J-M, zielony), czynnik transkrypcyjny normalnie wyrażany w płytce zwierzęcej i przyległej ektodermie nadoczodołowej (Ryc. 6I, I′; zielone kółka na Ryc. 6U), jak również kilka komórek w jelicie przednim (Takacs i in., 2004). Łańcuch komórek neuronalnych 1e11-pozytywnych przecina pasmo (Rys. 6K, czerwony), a komórki po cieńszej stronie pasma NK2.1-pozytywnego również wykazują ekspresję Gsc (Rys. 6L,N, czerwony). Kombinacja NK2.1 i Gsc w unikalny sposób wyróżnia nabłonek twarzowy nadoczodołowy na ustnej krawędzi płytki zwierzęcej (Ryc. 6I,I′, żółte komórki i Ryc. 6U, żółte kółka). Gęsto upakowane komórki kolumnowe rozszerzonego pasma otaczają bardziej spłaszczone komórki nabłonka, które wykazują ekspresję NK2.1, ale nie Gsc (Rys. 6M,N), podobnie jak komórki górnych regionów jamy ustnej normalnych zarodków (Rys. 6I, usta, m). Dodatkowym dowodem na to, że komórki te są podobne do komórek w pobliżu jamy ustnej normalnych zarodków jest to, że wykazują ekspresję hbn mRNA, która u normalnych 3-dniowych zarodków gromadzi się wokół krawędzi płytki zwierzęcej i rozciąga się do ektodermy nadoczodołowej (Rys.1, Rys. 6O). W zarodkach z ekspresją Six3, komórki hbn-dodatnie koncentrują się w cienkim nabłonku na biegunie wegetatywnym, a zatem znajdują się w tej samej pozycji w stosunku do rozszerzonej płytki zwierzęcej i komórek Nk2.1-dodatnich w górnym przedżołądku, jak w normalnych zarodkach (Fig.6P,Q). Strona przeciwległa do okolicy ustnej różnicuje się jako nabłonek cienkowarstwowy, wykazuje ekspresję markera ektodermy aboralnej, Spec1 (ryc. 6R-T) i może odpowiadać hbn-dodatniemu paskowi ektodermy aboralnej przylegającemu do płytki zwierzęcej. Łącznie, te wzorce ekspresji genów prowadzą do niezwykłego wniosku, że Six3 jest wystarczający do ponownego określenia losów komórek w większości pozostałej części zarodka, generując 3-dniowy zarodek składający się ze znacznie rozszerzonej, ale prawidłowo ukształtowanej domeny bieguna zwierzęcego z biegunowością oralną/aboralną. APD w normalnych i Six3-misexpressing embrionach jest zaznaczone niebieskimi okręgami na ryc. 6U.

Ponieważ Six3 poddany misexpressed może rozszerzyć cały APD i promować rozwój ektopowych neuronów, zapytaliśmy, które geny w zestawie genów E-APD byłyupregulated, używając mikromacierzy i pomiarów QPCR.Tabela 2 zawiera listę 10 takich genów, których poziomy mRNA są podwyższone co najmniej 3-krotnie w embrionach z wstrzykniętym mRNA Six3.

Six3 może hamować sygnalizację TGF-β, ale nie eliminuje biegunowości oralno-aboralnej

Misekspresja Six3 nie eliminuje biegunowości oralno-aboralnej, ponieważ markery ektodermy oralnej iaboralnej ulegają ekspresji po przeciwnych stronach zarodka, a neurony normalnie występujące w APD są ograniczone do pasma pośredniego.Jednakże, misexpressed Six3 zmniejsza ekspresję węzła, jak również lewego i chordin, w blastuli mezenchymy (Tabela 3, po lewej), być może dlatego, że Six3 zapewnia pozytywny wkład w ekspresję FoxQ2, który został wykazany do represji ekspresji węzła (Yaguchi i in… 2008), Zaskakująco, Six3 nie hamuje akumulacji mRNA bmp2/4 tak bardzo jak redukuje węzłową, chociaż ekspresja bmp2/4 wymaga funkcji węzłowej w normalnych zarodkach (Duboc i in., 2004). Ten pozorny paradoks może wynikać z kombinacji zmniejszonego hamowania sygnalizacji BMP2/4 przez Chordin w połączeniu z dyfuzją BMP2/4 i późniejsząautoaktywacją, jak wykazano w innych systemach (Biehs i in., 1996;Jones et al., 1992).

Kanoniczne sygnały Wnt, a nie TGF-β, zapobiegają ekspansji APD do bocznej ektodermy

Sygnały, które wyznaczają APD zależą od kanonicznej sygnalizacji Wnt, ponieważ jej eliminacja pozwala APD objąć prawie cały zarodek(Yaguchi i in., 2006)(Ryc. 1). Ponieważ Nodal i BMP zależą od kanonicznych sygnałów Wnt, wyeliminowaliśmy oba ligandy TGF-β za pomocą Nodal-MO (Yaguchi i in., 2008), aby sprawdzić, czy są one odpowiedzialne za zależne od Wnt ograniczenie APD. Rys.7B,F pokazuje, że tak nie jest, ponieważ neurony serotoninergiczne pozostają ograniczone do APD w tych embrionach. Jednakże, gdy morfanty Nodal otrzymują egzogenną Six3, liczba neuronów serotoninergicznych znacznie wzrasta i pojawiają się one w całej zwierzęcej połowie zarodka (ryc. 7D), tak jak to obserwuje się w zarodkach z ekspresjąΔcadherin (Yaguchi i in., 2006), co hamuje kanoniczną sygnalizację Wnt. Dlatego też ektopowa ekspresja Six3 może znieść inne sygnały, przypuszczalnie Wnt, które ograniczają te neurony doAPD normalnych zarodków.

Ale chociaż neurony serotoninergiczne nie tworzą się w ektodermie bocznej u Nodalmorphantów, to niektóre neurony nieserotoninergiczne tak (Ryc. 7B). Wynika to przede wszystkim, jeśli nie wyłącznie, z utraty sygnalizacji BMP2/4, ponieważ taki sam wynik uzyskuje się w zarodkach z wstrzykniętym BMP2/4-MO (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.A i R. D. Burke, niepublikowane). Ponieważ rozwój wszystkich neuronów zależy odSix3 w normalnym zarodku, zapytaliśmy, czy ektopowe neurony w Nodalmorphants również zależą od Six3 przez współwystrzykiwanie Nodal-MO i Six3-MO. Zgodnie z oczekiwaniami, neurony serotoninergiczne obecne na biegunie zwierzęcym w Nodalmorphants zostały utracone w podwójnych morfantach (Fig. 7G,H). Embriony te nie zawierają zróżnicowanych neuronów nieserotoninergicznych z wyrostkami aksonalnymi, chociaż zaobserwowano kilka miejsc immunoreaktywnych z 1e11. Mogą one wskazywać na obecność niekompletnie zróżnicowanych neuronów lub odzwierciedlać początkowe uprzedzenie neuronalne komórek ektodermy, które jest normalnie zniesione przez sygnalizację TGF-β.

Szóstka3 może antagonizować sygnalizację Wnt

Fakty, że APD nie rozszerza się w morfantach Nodal, ale rozszerza się w zarodkach z wstrzykniętąΔkadheryną i że Szóstka3 może przezwyciężyć kanoniczne efekty zależne od Wnt w bocznej ektodermie podnoszą możliwość, że Szóstka3 hamuje sygnalizację Wnt. Jednym z nich jest Wnt8, kluczowy sygnał wegetatywny wymagany dla normalnego rozwoju endomezodermy (Wikramanayake etal., 2004), co jest zgodne z brakiem rozwoju wegetatywnego w zarodkach poddanych ekspresji Six3. Łącznie, te wyniki sugerują, że granice APD są określane przez antagonizm Six3/Wnt.

Six3 nie wystarcza do represji ekspresji wnt inodal w APD

Zdolność Six3 do silnej downregulacji (bezpośrednio lub pośrednio) genów kodujących ligandy Wnt, jak również nodal, lefty i chordin, podnosi możliwość, że normalnie zapobiega ekspresji tych genów w APD. Aby to ocenić, najpierw zbadaliśmy wpływ Six3 na ekspresję genów w zarodkach, którym wstrzyknięto Δkadherynę, aby wyeliminować ewentualne efekty przeciwdziałające funkcji Six3 w endomezodermie. Zarówno dane z mikromacierzy, jak i QPCR wskazują, że w zarodkach składających się głównie z APD, Six3 tłumi ekspresję genów Wnt, a także genów węzłowych, lewych i koordynacyjnych (Tabela 3; Ryc. 8). Jednakże w prawidłowych zarodkach (wstrzykiwanych glicerolem) nie można wykryć represji tych genów przez Six3 (Tabela 3; Ryc. 8), co wskazuje, że dodatkowe mechanizmy chronią APD przed ekspresją Wnt i TGF-β w prawidłowym zarodku.

Regulacja innych szlaków sygnałowych przez Six3

Six3 również pozytywnie reguluje (bezpośrednio lub pośrednio) geny kodujące białka, które funkcjonują w innych szlakach sygnałowych (Tabela 3). Należą do nich m.in. elta, ligand Notcha, który pośredniczy w hamowaniu bocznym, kluczowym procesie w rozwoju neuronów, a także inne potencjalne regulatory neurogenezy. Do tych ostatnich należą fgf9/16/20, fgfr-like, receptor związany z błoną, pozbawiony domeny kinazy tyrozynowej, oraz frizzled5/8, receptor Wnt, który może przekazywać sygnały niekanoniczne, ale którego funkcja w APD jest nieznana (Croce etal., 2006). Przyszłe badania sprawdzą, jak aktywność tych szlaków sygnałowych i wczesnych czynników transkrypcyjnych zależnych od Szóstki3 współdziała w sieci regulacyjnej genów APD.

.