The structure of a membrane adenylyl cyclase bound to an activated stimulatory G protein

Membranowo-integralne cyklazy adenylowe (ACs) są kluczowymi białkami w transdukcji sygnału u ssaków, odpowiadając na szeroki wachlarz zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych wskazówek i generując cykliczny adenozyno-monofosforan (cAMP) dla szeregu zdarzeń sygnalizacyjnych (1, 2). Błonowe AC integruj± wiele kaskad sygnałowych – na przykład ł±cz±c wej¶cia z receptorów sprzężonych z białkami G (GPCR), zmiany wewn±trzkomórkowego stężenia Ca2+ (3) i lipidowe kaskady sygnałowe (4). U ssaków występuje dziewięć podtypów AC, klasyfikowanych jako AC1 do AC9 (5). Na podstawie sekwencji aminokwasowej, wszystkie podtypy AC mają tę samą przewidywaną architekturę. Są one polietopowymi białkami błonowymi, składającymi się z 12 transmembranowych (TM) heliksów i posiadającymi cytozolowe N i C termini. Po pierwszych sześciu domenach TM (TM1-TM6) polipeptydu AC następuje region cytozolowy, który zawiera domenę katalityczną (C1a), a następnie domenę C1b, drugi region TM, wiązkę TM7-TM12, a następnie drugą domenę katalityczną (C2a) i C-końcową domenę C2b. N- i C-końcowe części białek są wysoce zmienne, natomiast najbardziej konserwowane są domeny C1a i C2a, które należą do klasy III cyklaz nukleotydylowych (5, 6). Krystalografia rentgenowska chimerycznego AC5C1/AC2C2 w kompleksie ze stymulującą podjednostką białka G Gαs (7, 8) ujawniła kluczowe cechy maszynerii katalitycznej AC i pomogła w sformułowaniu szczegółowego mechanizmu produkcji cAMP przez AC zależne od białek G (7, 8). Jednakże każda z błonowych AC u ssaków zawiera dodatkowe elementy strukturalne, takie jak domena rozprzestrzeniająca się w błonie i domena helikalna (HD), które są krytyczne dla prawidłowego montażu tych białek i ich funkcji enzymatycznej.

Wraz z klonowaniem pierwszej AC u ssaków pojawiła się sugestia, że AC mogą przypominać transportery (9). Wczesne badania AC w Paramecium sugerowały, że część TM białka może pełnić funkcję kanału jonowego (10). Zgodnie z ich funkcją kanałową, sekwencja części TM Paramecium AC jest homologiczna do sekwencji napięciowo bramkowanych kanałów potasowych (11). Obecność polytopowej wiązki helis TM i cytozolowej domeny wiążącej adenozyno-5′-trifosforan (ATP) wskazuje na powierzchowne strukturalne i funkcjonalne podobieństwo do transporterów ABC (ATP-binding cassette). Jednakże nie ma istotnego podobieństwa sekwencji pomiędzy AC a jakimikolwiek znanymi białkami podobnymi do transporterów lub kanałów jonowych. Badania mikobakteryjnych i ssaczych ACs wskazywały na możliwą rolę domen TM w prawidłowym składaniu enzymu (7, 12, 13). Jednak strukturalna i funkcjonalna rola regionu TM pozostaje niejasna.

AC9 jest podtypem cyklazy ulegającym ekspresji w wielu tkankach, w tym w płucach, mózgu i sercu (14, 15). Został on obszernie przebadany w połączeniu z kompleksami białek zakotwiczających kinazy A (AKAP) (16). Zaproponowano, że AC9 jest połączony poprzez AKAP Yotiao z kanałami potasowymi IKs, kinazą białkową A, fosfodiesterazą PDE4D3 i fosfatazą białkową PP1 (17). AC9 został zidentyfikowany jako potencjalny cel lekowy w astmie (5). rs2230739, polimorfizm AC9, którego wynikiem jest mutacja Ile772→Met, jest związany ze zmianami w odpowiedzi na wziewny kortykosteroid budezonid (18). W kanonicznym modelu aktywacji AC, forskolina wiąże się z miejscem allosterycznym przylegającym do miejsca katalitycznego, co prowadzi do aktywacji enzymu. Interakcja pomiędzy AC i podjednostką Gαs w stanie związanym z 5′-trifosforanem guanozyny (GTP) również prowadzi do aktywacji AC, przy czym maksymalna aktywacja AC jest osiągana w obecności zarówno forskoliny, jak i białka Gαs. Jednakże, chociaż porównania sekwencji z innymi AC wskazują, że AC9 zawiera miejsce allosteryczne, a jedno z wcześniejszych doniesień sugerowało, że forskolina może aktywować AC9 (14), w kilku badaniach stwierdzono, że AC9 jest niewrażliwa na forskolinę, a konsensus w tej dziedzinie jest taki, że AC9 stoi w swojej własnej kategorii jako białko niewrażliwe na forskolinę (19, 20).

Wyraziliśmy i oczyściliśmy bydlęce AC9 (fig. S1A) i potwierdziliśmy jego funkcjonalną integralność za pomocą testów akumulacji cAMP (Fig. 1, A do C). Oczyszczone białko katalizowało konwersję ATP w cAMP i mogło być hamowane przez MANT-GTP (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-methylanthraniloyl)guanozyno-5ʹ-O-trifosforan), hamujący analog substratu AC (Fig. 1B). Rekonstytucja białka z Gαs aktywowanym przez GTPγS (rys. S1, B i C) prowadziła do silnej aktywacji cyklazy (rys. 1A). Testy zdolności uniwersalnego aktywatora AC, forskoliny, do aktywacji AC9 in vitro wykazały bardzo słabą aktywację AC9 w stężeniach submilimolarnych (Fig. 1A). Natomiast forskolina mogła aktywować kompleks AC9-Gαs z medianą efektywnego stężenia (EC50) 111 μM (ryc. 1A i tabela S2). Tak więc, chociaż zarówno forskolina, jak i podjednostka Gαs były zdolne do częściowej aktywacji białka, pełna aktywacja mogła być osiągnięta tylko przez połączenie tych dwóch czynników. Ponadto, jak oczekiwano od allosterycznego modulatora AC, forskolina przesunęła medianę stężenia hamującego (IC50) analogu substratu AC9 MANT-GTP w kierunku niższego stężenia (ryc. 1, B i C). Dlatego nasze eksperymenty in vitro z użyciem oczyszczonej pełnej długości AC9 i białka Gαs wyraźnie pokazują, że forskolina działa na kompleks białkowy AC9-Gαs jako klasyczny aktywator allosteryczny.

Przygotowaliśmy zamrożone, uwodnione siatki cryo-EM zawierające kompleks AC9-Gαs w obecności MANT-GTP i forskoliny w stężeniach (0,5 mM dla każdego liganda) przekraczających wartości IC50 i EC50 dla tych dwóch związków i poddaliśmy je analizie cryo-EM pojedynczej cząsteczki (fig. S2). Najlepszy podzbiór cząsteczek dał w wyniku mapę gęstości odpowiadającą kompletnemu kompleksowi cyklazy i podjednostki białka G, rafinowaną do rozdzielczości 3,4 Å (ryc. 1D). Kompletna mapa gęstości, wraz z mapami uzyskanymi po ukierunkowanym rafinowaniu części błonowej (rys. S3) i cytozolowej (rys. S3) kompleksu, pozwoliła nam na zbudowanie kompletnego trójwymiarowego (3D) modelu kompleksu AC9-Gαs (rys. 1E). Mapa i model ujawniły kilka kluczowych elementów kompleksu AC9-Gαs: (i) wiązkę 12 domen TM kompleksu AC9, (ii) HD łączącą wiązkę TM i domenę katalityczną AC9 oraz (iii) domenę katalityczną AC9 związaną z podjednostką Gαs aktywowaną GTPγS (Fig. 1, D i E, oraz fig. S6).

Domena TM białka posiada pseudo-dwukrotną symetrię, cechę często spotykaną u transporterów solutu z rodziny opornego podziału nodulacji, ABC lub major facilitator (Fig. 2, A do C). Transbłonowe heliksy TM1-TM6 i TM7-TM12 można nałożyć na siebie z odchyleniem średniokwadratowym (RMSD) wynoszącym 3,4 Å na 176 resztach (Rys. 2D). Wewnętrzna pseudosymetria wspiera hipotezę, że błonowe AC u ssaków powstały w wyniku duplikacji genów z prostego systemu, prawdopodobnie podobnego do „pół-cyklazy” Cya/Rv1625c z Mycobacterium tuberculosis (12). Interfejs pomiędzy dwiema połówkami TM w AC9 jest utworzony przez heliksy TM1, TM4 i TM6 w N-końcowej „połowie” wiązki domeny TM oraz TM7, TM10 i TM12 w C-końcowej części białka (Rys. 2, B i C). Sklonowaniu pierwszego genu AC u ssaków towarzyszyła sugestia, że AC mogą działać jako transportery, w oparciu o ich pierwotną sekwencję (9). Nasza struktura nie ujawnia żadnej oczywistej ścieżki translokacji rozpuszczalnika w obrębie wiązki domen TM, przy czym heliksy TM AC9 są upakowane blisko siebie. Chociaż micela digitoniny prawdopodobnie zapewnia środowisko podobne do dwuwarstwy lipidowej, możliwe jest, że konformacja heliksów TM w fizjologicznym środowisku błony jest inna.

Hepleksy TM6 i TM12 AC9 rozciągają się do cytozolu, tworząc 40-rezydowe HDs zwane tutaj HD1 (w tym heliksy h1.1 i h2.1) i HD2 (heliksy h2.1 i h2.2; Fig. 2, E i F). Region ten jest ważny dla funkcji ACs i cyklaz guanylowych u prokariotów i eukariotów (12). Rezydy od Leu323 do Met333 helisy h1.1 oraz od Ile1022 do Leu1032 helisy h2.1 tworzą klasyczną spiralę (Rys. 2F). Wcześniej opisaliśmy HD Cya, błonowego AC z Mycobacterium intracellulare, homologicznego do Rv1625c z M. tuberculosis (12). HD AC9 wykazuje pewne różnice w porównaniu z Cya we względnym ułożeniu regionu rdzeniowego na granicy z domeną katalityczną (ryc. 2, E i F, oraz ryc. S7, A i B). W M. intracellulare Cya krótkie heliksy są ściśle związane na C-końcu zwoju (rys. S7B). Natomiast cewka AC9 odwija się na C-końcu h1.1 i h2.1 (ryc. 2F, ryc. S7B i ryc. S8A). Ten region enzymu jest krytyczny dla funkcji AC i cyklaz guanylowych. Genetyczne mutacje związane z chorobą mapują się do HDs AC5 w rodzinnej dyskinezie i miokymii twarzy (22, 23) oraz do mutacji cyklazy guanylowej siatkówki (retGC1) w wrodzonej amaurozie Lebera-1 (24) i dystrofii czopkowo-rodowej-6 (CORD6) (25). Możemy teraz doprecyzować pozycje mutacji związanych z chorobą, wykorzystując strukturę bydlęcej AC9, znacznie bliższą ludzkim cyklazom nukleotydylowym związanym z patologią w porównaniu z M. intracellulare Cya.

Funkcja wiązki 12-TM w AC ssaków była niejasna. Ostatnie badania w mykobakterii Rv1625c zasugerowały możliwą funkcję receptora dla błoniastego regionu rozprzestrzeniającego się w homologu mykobakterii (12). Nie mogliśmy wyodrębnić części zewnątrzkomórkowej powierzchni AC9 (Fig. 2, A i B) i nie jest jasne, czy część białka związana z błoną zawiera funkcjonalnie istotne miejsca wiązania dla hipotetycznych ligandów. Podobnie, domena C1b, która łączy katalityczną domenę C1a z TM7, nie może być rozwiązana w naszej rekonstrukcji (fig. S6, E do G). Nasza struktura dostarcza jednak wskazówek, w jaki sposób interakcje z regionem rozprzestrzeniającym się w błonie mogłyby wpływać na katalityczną funkcję białka. Helisy TM6 i TM12 są ciągłe z h1.1 i h2.1 w HD. TM6 i TM12 znajdują się na interfejsie wiązek helis TM1-TM6 i TM7-TM12 i są bocznie eksponowane na warstwę lipidową (ryc. 2E i ryc. S8B). Można sobie wyobrazić, że bezpośrednie interakcje TM6 lub TM12 z lipidami, małymi cząsteczkami lub innymi białkami mogą bezpośrednio wpływać na domenę katalityczną poprzez zmianę orientacji helikali h1.1 i h2.1 (fig. S8B).

Kompletna domena katalityczna AC9 składa się z dwóch połówek, C1a i C2a (Fig. 1E i 3A), podobnie jak wcześniej rozwiązane struktury rentgenowskie rozpuszczalnych domen błonowych AC (fig. S7, A i C). Jak wykazano wcześniej, główny interfejs interakcji między podjednostką α białka G a domeną katalityczną AC9 jest utworzony przez wstawienie helisy Gαs Switch II do rowka utworzonego przez helisy α′2 i α′3 domeny C2a AC9 (fig. S7, D do F). Region HD h1.2 (reszty od 340 do 360) znajduje się w pobliżu powierzchni oddziałującej z Gαs (rys. S7E). Ten region białka wydaje się być wysoce dynamiczny i nie udało nam się zlokalizować reszt łączących His361 i Pro384 z AC9 (rys. S7E). Niemniej jednak, bliskość tego regionu do interfejsu białko G-AC sugeruje, że ten element struktury AC9 prawdopodobnie przyczynia się do interakcji między AC9 i Gαs.

Wykryto element o silnej gęstości zlokalizowany w obrębie miejsca wiążącego ATP i miejsca forskolinowego (Fig. 3, A i B oraz fig. S9, A do C). Ta gęstość wykazywała powierzchowne podobieństwo do gęstości MANT-GTP, ale nie odpowiadała jego oczekiwanej lokalizacji (Figura 3A). Gęstość w miejscu forskoliny wydawała się pokrywać z oczekiwaną pozycją forskoliny (ryc. 3A). Podobna cecha gęstości była obecna na mapie zrekonstruowanej z obrazów próbki pozbawionej forskoliny (Fig. 3B i Fig. S9B). Tak więc, niezależnie od obecności MANT-GTP i/lub forskoliny, miejsca aktywne i allosteryczne wydają się być zajęte przez gęstość zgodną z peptydem (Fig. 3, A i B, oraz Fig. S9, A i B). Ukierunkowana klasyfikacja 3D i rafinacja ujawniły związek między tą gęstością a C-końcowym regionem domeny C2a AC9 (Fig. 3C i fig. S3 i S9C). Chociaż cechy gęstości w tej mniej zaludnionej klasie 3D (mapa SOL-C, obliczona przy użyciu tylko 16 343 cząsteczek) nie są wystarczająco silne, aby pewnie zbudować atomowy model białka, używając dostępnej gęstości jako ograniczenia, mogliśmy przypisać ją do reszt Cys1246 do Pro1275 C-końca AC9, lub domeny C2b (Fig. 3C i fig. S9C). Wysoka jakość gęstości wewnątrz miejsca allosterycznego i aktywnego (Rys. 3A i Rys. S9, A i D) pozwoliła nam na zbudowanie modelu peptydu okluzyjnego, odpowiadającego resztom Ile1263 do Pro1275 domeny C2b AC9 (Rys. S9D). Ten region jest wysoce konserwowany wśród kręgowych homologów AC9 (fig. S9E), ale nie w innych izoformach AC (AC1 do AC8) (fig. S10).

Aby określić funkcjonalną rolę domeny C2b w AC9, porównaliśmy właściwości enzymatyczne dzikiego typu i okrojonego białka pozbawionego domeny C2b AC91250 (Fig. 3D i fig. S11A). Oba konstrukty wykazały porównywalną zdolność do konwersji ATP do cAMP, z podobnymi wartościami stałej Michaelisa (Km) i Vmax (Fig. 3E i tabela S2). AC91250 był aktywowany przez forskolinę i hamowany przez MANT-GTP w sposób podobny do AC9 (fig. S11, B do D). Dodanie Gαs silnie stymulowało wytwarzanie cAMP przez AC9 (Fig. 3F), z jednoczesnym wzrostem jego Km dla ATP. Zgodnie z tym, że ogon hamuje wiązanie ATP, AC91250 wykazywał wysokie Vmax, ale przy znacznie niższej wartości Km (Rys. 3F). Jest to silna wskazówka, że region C2b odgrywa funkcjonalną rolę w stanie związanym z białkiem G dla AC9. Usunięcie regionu C2b zwiększa powinowactwo AC9 do ATP w obecności Gαs, umożliwiając białku osiągnięcie maksymalnej szybkości katalizy przy znacznie niższych stężeniach ATP. Zmniejszenie powinowactwa do substratu (ATP) poprzez okluzję miejsca aktywnego przez domenę C2b może stanowić mechanizm regulacyjny kontrolujący produkcję cAMP przez AC9 związanego z białkiem G.

Aby ocenić zmiany konformacyjne w stanie okluzji AC9, wyznaczyliśmy strukturę cryo-EM kompleksu AC91250-Gαs w obecności MANT-GTP i forskoliny (AC91250-Gαs-MF; ryc. 3, G i H oraz fig. S12 i S13). Rekonstrukcja z rozdzielczością 4,2Å pozwoliła na wyraźne określenie gęstości dla MANT-GTP i forskoliny związanych w ich kanonicznych miejscach wiązania (rys. 3, G i H, oraz 4; fig. S13, E do G). Porównanie rozmieszczenia domen katalitycznych kompleksów AC91250-Gαs-MF i AC9-Gas ujawniło niewielką względną rearanżację C1a zależną od obecności peptydu okluzyjnego w miejscach aktywnych i allosterycznych (Fig. 4, A i B); RMSD między atomami ruchomych domen C1a (Ile1380 do Gln574) dwóch porównywanych struktur wyrównanych za pomocą ich domen C2a (Gln1049 do Lys1245) wynosi 1,9 Å. Subtelny ruch całej domeny obserwowany w stanie okluzji AC9 przesuwa reszty aminokwasowe C1a zaangażowane w wiązanie nukleotydów o ~ 3 Å (fig. S13H). W związku z tym rdzeń domeny katalitycznej AC9 przyjmuje konformację okludowaną, z peptydem pochodnym C2b zajmującym miejsca aktywne i allosteryczne białka (fig. S9, D i E), czemu towarzyszy zniekształcenie miejsca aktywnego w porównaniu z tym obserwowanym w stanie związanym z MANT-GTP i forskoliną.

Struktura kompleksu AC9-Gαs w konformacji okluzyjnej pozwoliła nam zrewidować ustalony model transdukcji sygnału opartej na cAMP (7, 26) (rys. S14). Aktywacja kaskady GPCR musi prowadzić do utworzenia formy AC związanej z podjednostką Gαs, aby wygenerować cAMP. Jednakże, opisany tutaj stan okluzji dodaje pośredni element, który wcześniej nie był doceniany. Stan okludowany i stan aktywny AC9 prawdopodobnie istnieją w równowadze; próbka, która wytworzyła rekonstrukcję stanu okludowanego może być aktywowana przez białko G i może wytwarzać cAMP. Znacznie zmniejszone Km białka dla ATP (Rys. 3F) sugeruje, że okluzja miejsca ATP może być preferowana w obecności białka G. Przyszłe eksperymenty pomogą określić funkcjonalną rolę tej konformacji białka w cyklu katalitycznym AC9.

Architektura AC9 ujawniona w tym badaniu dostarcza wskazówek na temat możliwej roli części osadzonych w błonie w AC ssaków. Jedną z widocznych funkcji domeny błonowej jest umożliwienie prawidłowego złożenia aktywnej cyklazy. Jest to osiągane przez TM6 i TM12, które stanowią ramę dla HD. Jest prawdopodobne, że elementy białka, których nie można obecnie rozdzielić, tj. terminus N i domena C1b, przyczyniają się do składania i regulacji funkcji cyklazy AC9 (fig. S6, E do G). Dlatego, pomimo oddzielenia domeny katalitycznej o ~ 40 Å od warstwy lipidowej, można sobie wyobrazić, że część błonowa białka może wpływać na domenę katalityczną poprzez HD i przylegające do niej regiony pętli.

Zamknięty stan kompleksu z C-końcowym peptydem wiążącym zarówno miejsce aktywne, jak i allosteryczne AC9 może reprezentować ważny mechanizm autoregulacyjny wbudowany w maszynerię transdukcji sygnału opartą na AC. Obecność peptydu może pomóc wyjaśnić niespójne obserwacje niewrażliwości AC9 na forskolinę (14, 19, 20), wspierając zależną od kontekstu autoregulację AC9. Forskolina jest roślinnym, drobnocząsteczkowym aktywatorem AC; postuluje się istnienie naturalnego aktywatora lub inhibitora tego miejsca w ACs (20), ale jak dotąd nie został on zidentyfikowany. W przypadku AC9 możemy teraz wykazać, że (i) forskolina jest zdolna do aktywacji enzymu i (ii) prawdopodobnym naturalnym regulatorem miejsca allosterycznego jest część domeny C2b wiążąca się z aktywnym regionem białka. Sugerujemy, że po aktywacji przez białko G (fig. S14, A do D), C2b okluduje centrum reakcji AC9 i blokuje aktywność enzymatyczną, zapobiegając nadmiernej produkcji cAMP w komórce (fig. S14E). Jest to zgodne z niedawnym doniesieniem o autoinhibicyjnej funkcji domeny C2b AC9 w kontekście komórkowym (27). Nasze odkrycia mogą pomóc utorować drogę w kierunku generowania nowych podejść w odkrywaniu leków, które wykorzystują autoregulacyjny mechanizm molekularny ujawniony przez strukturę AC9-Gαs.

.