Cykl Calvina-Bensona jest podstawą wiązania węgla u wszystkich organizmów fotosyntetyzujących. Jednakże stosunkowo niewiele wiadomo na temat tego, w jakim stopniu jego działanie różni się pomiędzy gatunkami. Wykorzystując metodę profilowania metabolitów, odkryliśmy różnice w poziomach kluczowych intermediatów cyklu Calvina-Bensona wśród gatunków C3 i C4. Te różnice w pulach metabolitów zaobserwowano pomiędzy gatunkami C3, jak również pomiędzy roślinami C3 i C4. Praca ta podnosi interesującą możliwość, że różne naciski selekcyjne na składniki cyklu Calvina-Bensona doprowadziły do jego niezależnej optymalizacji między gatunkami.
W 1954 roku Melvin Calvin, Andrew Benson i James Bassham opublikowali szlak metaboliczny wykorzystywany do wiązania atmosferycznego CO2 – cykl Calvina-Bensona (Bassham et al., 1954). Ich fundamentalne odkrycia opierały się na karmieniu algi Chlorella CO2 znakowanym 14C i śledzeniu znakowania metabolitów w czasie (Bassham i in., 1954; Sharkey 2018). Odkryli oni, że cykl składa się z trzech faz: po pierwsze, enzym karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5-bisfosforanowa (Rubisco) wiąże CO2 używając rybulozo-1,5-bisfosforanu (RuBP) jako akceptora, wytwarzając dwie 3-węglowe cząsteczki, 3-fosfoglicerynian (3-PGA). Po drugie, ATP i NADPH generowane podczas fotosyntetycznego łańcucha transportu elektronów (zależne od światła reakcje fotosyntezy) są wykorzystywane do fosforylacji, a następnie redukcji 3-PGA do fosforanu triozy (triozo-P). Po trzecie, akceptor CO2 RuBP jest regenerowany poprzez serię reakcji (Ramka 1). Większość enzymów biorących udział w tym cyklu została odkryta wcześniej lub wkrótce potem (Horecker i in. 1951; Racker i in., 1953; Mayoudan i in., 1957). Od tego czasu powszechnie przyjmuje się, że działanie cyklu Calvina-Bensona jest silnie konserwowane wśród różnych gatunków roślin.
Cykl Calvina-Bensona składa się z trzech faz: (1) wiązanie węgla, (2) redukcja i (3) regeneracja akceptora CO2.
Karboksylacja zachodzi za pośrednictwem karboksylazy/oksygenazy rybulozo-1,5-bisfosforanowej (Rubisco), która wiąże CO2 przy użyciu rybulozo-1,5-bisfosforanu (RuBP) jako akceptora, wytwarzając przy tym dwie 3-węglowe cząsteczki 3-fosfoglicerynianu (3-PGA). 3-PGA jest następnie fosforylowany przez kinazę fosfoglicerynianową (PGK) i redukowany do fosforanu triozy (triozo-P) przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (GAPDH) w fazie redukcji. Cykl ten zużywa 3 ATP i 2 NADPH na cząsteczkę utrwalonego CO2. Trioza-P może być transportowana z chloroplastu w celu wytworzenia sacharozy w cytozolu. Aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu (FBP ald) może przekształcić triozę-P w fruktozo-6-fosforan (F6P), półprodukt używany do produkcji skrobi. Ponadto, trioza-P może być przekształcona w RuBP w serii reakcji regeneracyjnych w celu wiązania większej ilości cząsteczek CO2.
Skróty: fructose-1,6-bisphosphate (FBP), fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase), erythrose-4-phosphate (E4P), sedoheptulose 1,7-bisphosphate aldolase (SBP ald), sedoheptulose-1,7-bisphosphate (SBP), sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase), sedoheptulozo-7-fosforan (S7P), transketolaza (TK), rybozo-5-fosforan (R5P), ksylulozo-5-fosforan (Xu5P), izomeraza rybozo-5-fosforanu (RPI), epimeraza rybulozo-5-fosforanu (RPE), rybulozo-5-fosforan (Ru5P), fosforybo-5-fosforynaza (PRK). Enzymy katalizujące reakcje nieodwracalne zaznaczone są grubą pogrubioną strzałką (tj. Rubisco, FBPaza, SBPaza i PRK).
W zdecydowanej większości roślin lądowych, wraz z zależnymi od światła reakcjami fotosyntezy, cykl Calvina-Bensona prowadzony jest głównie w komórkach mezofilu liści. Jednakże Rubisco słabo rozróżnia CO2 i O2 (Bowes i in., 1971) i wiązanie cząsteczki O2 zamiast CO2 powoduje fotorespirację – energetycznie kosztowną ścieżkę ratunkową w celu odzyskania RuBP. Po tym jak atmosferyczne stężenie CO2 gwałtownie spadło 2,3 miliarda lat temu (Bekker i in., 2004), wyewoluowały dwa mechanizmy koncentracji węgla, ograniczając ilość fotorespiracji. Każda z tych modyfikacji podstawowego procesu fotosyntezy, fotosyntezy C4 i metabolizmu kwasów trawiennych (CAM), powstała wielokrotnie (Sage i in., 2011). Fotosynteza C4 polega na przestrzennym rozdzieleniu fotosyntezy w taki sposób, że składniki zarówno reakcji zależnych od światła, jak i cyklu Calvina-Bensona zachodzą w komórkach mezofilu i osłonek wiązek (Ramka 2). Pomimo różnic w anatomicznej lokalizacji wiązania węgla, do tej pory niewiele było wiadomo o tym, jak działanie cyklu Calvina-Bensona może się różnić u roślin C4 w porównaniu z roślinami C3, a także pomiędzy roślinami C3.
W 1966 roku Hal Hatch i Roger Slack odkryli fotosyntezę C4 (Hatch i Slack, 1966), która obejmuje mechanizm koncentracji węgla dodany do regularnej ścieżki wiązania węgla C3. Wykorzystali oni znakowanie 14C do wykazania, że CO2 w liściach trzciny cukrowej był najpierw wiązany do kwasu 4-węglowego, a nie do 3-fosfoglicerynianu (3-PGA), jak w roślinach C3. Rośliny C4 używają karboksylazy fosfoenolopirogronianowej (PEPC) jako początkowego enzymu wiążącego węgiel w komórkach mezofilu. Kwas 4-węglowy (jabłczan lub asparaginian w zależności od typu fotosyntezy C4) produkowany w komórkach mezofilu dostaje się do komórek osłonek wiązek, gdzie jest dekarboksylowany i uwalniany jest CO2. Ten mechanizm koncentracji węgla pozwala Rubisco działać prawie wyłącznie jako karboksylaza podczas cyklu Calvina-Bensona w komórkach osłonki wiązki. Oprócz rekonfiguracji istniejących enzymów metabolicznych, ścieżka C4 wymaga rozwoju wyspecjalizowanej anatomii liścia (anatomia Kranza), która obejmuje zwiększenie odstępów między żyłkami i rozmiaru komórek osłonki wiązki. Klasycznie wyróżnia się trzy różne typy fotosyntezy C4, których nazwy pochodzą od podstawowego enzymu odpowiedzialnego za reakcję dekarboksylacji w komórkach osłonki wiązkowej: NAD-ME, NADP-ME lub typ PEPCK. Skróty: anhydraza węglanowa (CA), oksalooctan (OA), NADP-zależna dehydrogenaza jabłczanowa (NADP-MDH), jabłczan (M), NADP-zależny enzym jabłkowy (NADP-ME), pirogronian (Pyr), dikinaza pirogronianowo-ortofosforanowa (PPDK), fosfoenolopirogronian (PEP).
Zmienność metabolitów cyklu Calvina-Bensona między gatunkami
Cykl Calvina-Bensona jest bez wątpienia jednym z najbardziej krytycznych szlaków biochemicznych na Ziemi, jako droga asymilacji węgla u roślin – serce fotosyntezy. Ale czy wszystkie gatunki roślin przebiegają tą ścieżką w ten sam sposób? Arrivault i wsp. (2019) sprofilowali obfitość metabolitów cyklu Calvina-Bensona z pięciu roślin C3 (w tym Arabidopsis i kilku ważnych roślin uprawnych, takich jak ryż, pszenica i maniok) oraz czterech roślin C4 (w tym kukurydzy). Całkowite metabolity były ekstrahowane z dojrzałych liści i mierzone przy użyciu chromatografii cieczowej w odwróconej fazie sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). W celu zapewnienia wiarygodnej kwantyfikacji, do próbek dodawano wzorce metabolitów wewnętrznych znakowanych izotopami; 3-PGA był kwantyfikowany enzymatycznie. Profile metabolitów różnych gatunków roślin zostały porównane przy użyciu analizy głównych składowych.
Uderzająco, Arrivault et al. (2019) odkryli znaczące różnice w profilach metabolitów intermediatów cyklu Calvina-Bensona wśród pięciu gatunków C3, które badali. Intermediaty, które najbardziej się różniły, obejmowały bezwzględne poziomy 3-PGA, triozę-P, rybulozo-5-fosforan (Ru5P) i ksylulozo-5-fosforan (Xu5P). Względne poziomy RuBP w porównaniu z poziomami intermediatów biorących udział w regeneracji RuBP były różne u poszczególnych gatunków. Ponadto, autorzy wykazali zmienność względnych poziomów par metabolitów, takich jak fruktozo-1,6-bisfosforan (FBP) i fruktozo-6-fosforan (F6P), które są połączone poprzez nieodwracalną reakcję FBPazy; oraz pary metabolitów sedoheptulozo-1,7-bisfosforanu (SBP) i sedoheptulozo-7-fosforanu (S7P), które są nieodwracalnie przekształcane przez SBPazę. W większości przypadków, pięć gatunków C3 wyraźnie oddzielało się od siebie w analizie składowych głównych. Stopień ich oddzielenia zależał od tego, czy dane były normalizowane do świeżej masy, zawartości chlorofilu czy zawartości białka. Zróżnicowanie tych półproduktów w obrębie pięciu gatunków C3 wskazuje na różnice w sposobie prowadzenia przez rośliny tej samej ścieżki wiązania węgla. Ta informacja ma konsekwencje dla strategii, które mają na celu poprawę fotosyntezy. Na przykład, SBPaza może ograniczać tempo fotosyntezy (Zhu i in., 2007), a nadekspresja może zwiększać wydajność fotosyntezy (Lefebvre i in., 2005; Feng i in. 2007; Ding i in., 2016; Driever i in., 2017). Tak więc, zmiana aktywności pojedynczego enzymu w cyklu Calvina-Bensona może wpłynąć na tempo fotosyntezy, a następnie na biomasę i plon. Wiadomo jednak, że skuteczność tego podejścia jest różna u poszczególnych gatunków. Istniejące wcześniej zróżnicowanie poziomów metabolitów SBP i S7P między gatunkami C3 zgłoszone przez Arrivault et al. (2019) jest zatem ważne i może zapewnić wgląd w zmienną odpowiedź fotosyntezy na zwiększenie ilości SBPazy.
Ponieważ mechanizm koncentracji węgla roślin C4 ogranicza fotorespirację, być może mniej zaskakujące było to, że pierwszy produkt fotorespiracji, 2-fosfoglikolan (2-PG), był mniej obfity u gatunków C4 niż u gatunków C3. Co więcej, rośliny C4 miały niższy poziom RuBP niż rośliny C3, co jest zgodne z ich niższym poziomem inwestycji w Rubisco. Jednakże, nawet gdy pominięto poziomy 2-PG i RuBP z zestawu danych, poziomy metabolitów C3 i C4 prawie zawsze były rozdzielone w analizie składowych głównych. Różnice te były stałe, niezależnie od tego czy dane były normalizowane do świeżej masy, zawartości chlorofilu czy zawartości białka, a więc zmiany te wskazują, że enzymy odpowiedzialne za generowanie metabolitów podejmują katalizę w różnym tempie u różnych gatunków. Autorzy używają terminu „tryb pracy” cyklu Calvina-Bensona, aby opisać te różnice – cykl działa inaczej u różnych gatunków, nawet jeśli zaangażowane są te same enzymy, co prowadzi do obserwowanych zmian we względnych poziomach produktów pośrednich. Dlatego proponują, że różnice w cyklu Calvina-Bensona między roślinami C3 i C4 są szersze niż proste przestrzenne przeniesienie do komórek osłonki wiązki w tych ostatnich, i obejmują adaptację w trybie działania cyklu.
Perspektywy na przyszłość
Ustalenie, że tryb działania cyklu Calvina-Bensona może się różnić jest interesujące, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że struktura szlaku (pod względem zaangażowanych enzymów i ich sekwencji reakcji w cyklu) jest wysoce konserwowana. Jednak w ciągu milionów lat, jakie upłynęły od pojawienia się cyklu, stosunek O2 do CO2 w atmosferze dramatycznie się zmienił. Uważa się, że zmiany te przyczyniły się do tego, że niektóre gatunki roślin wykształciły mechanizmy koncentracji węgla. Autorzy proponują, że niski poziom CO2 w połączeniu ze specyficznymi warunkami środowiskowymi mógł doprowadzić do rozwoju różnych trybów pracy cyklu Calvina-Bensona. W ten sposób obserwowane różnice w profilach metabolitów mogą odzwierciedlać różne naciski selekcyjne na sposób regulacji cyklu Calvina-Bensona w różnych liniach rozwojowych roślin. Podej¶cie zastosowane przez autorów do analizy intermediatów cyklu Calvina-Bensona może być teraz zastosowane do większej liczby gatunków, a byłoby to szczególnie interesuj±ce, gdyby obejmowało szerszy zakres rodzin ro¶lin w różnych ¶rodowiskach. Mogłoby to ujawnić, czy zróżnicowanie jest ściśle związane z taksonami filogenetycznymi, czy ze specyficznymi środowiskami, do których rośliny się przystosowały.
Również, rośliny C4 analizowane w Arrivault i in. prowadzą fotosyntezę C4 typu NADP-ME. Tak więc, obiecującą linią dalszych badań byłoby sprawdzenie, czy podobne zmiany w intermediatach cyklu Calvina-Bensona są obserwowane we wszystkich trzech typach metabolizmu C4, czy też są one specyficzne dla typu NADP-ME.
Ta praca jest doskonałym punktem wyjścia do odkrycia, jak te różne tryby cyklu Calvina-Bensona są kontrolowane na poziomie molekularnym. Podczas gdy profilowanie metabolitów umożliwia bezstronne podejście do oceny różnic w poziomach intermediatów pomiędzy różnymi gatunkami, przyczyny leżące u podstaw tych różnic pozostają do ustalenia. Różnice między gatunkami mogą wynikać z różnic w ekspresji genów i późniejszej aktywności białek, różnic w sekwencji aminokwasów wpływających na kinetykę lub potranslacyjnej regulacji enzymów. Warto zauważyć, że prawie wszystkie enzymy cyklu Calvina-Bensona podlegają przynajmniej pewnej formie regulacji redoks, głównie poprzez system tioredoksyna (TRX)/ferredoksyna (Fd) (Buchanan i Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). Integracja tych danych dotyczących transkryptów, obfitości białek i aktywności enzymów z poziomami metabolitów może ujawnić molekularne podstawy zmienności. Co więcej, obserwowane wahania w pulach metabolitów mogą być również związane z zapotrzebowaniem na pewne intermediaty, szczególnie te, które są wycofywane z cyklu Calvina-Bensona. Na przykład, na strumień przez cykl mogą wpływać ścieżki wyjścia umożliwiające syntezę skrobi (poprzez F6P), sacharozy i izoprenoidów (poprzez triozę-P), aminokwasów poprzez szlak shikimatu (poprzez E4P), a także tiaminy i nukleotydów (poprzez R5P) (Raines, 2011).
Arrivault i wsp. (2019) donoszą o interesującym zróżnicowaniu w sposobie działania komponentów cyklu Calvina-Bensona u różnych gatunków roślin. To z pewnością będzie katalizatorem dalszych badań nad tym, jak rośliny dostosowały tę fundamentalną i starożytną ścieżkę wiązania węgla do różnych środowisk.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
3rd,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
.
.
.
,
–
.
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
.
.
.
,
.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
.
,
.
,
,
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
,
–
.
,
.
.
.
,
–
.
,
,
.
.
.
,
–
.
,
,
,
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
,
–
.
,
,
, et al.
.
.
,
.
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
,
–
.
,
,
.
.
.
,
–
.
.
.
.
. doi: .
,
,
.
.
.
,
–
.
.