Dos fragmentos de DNA que inicialmente tentamos amplificar, apenas tlp2, che1P, e cheA1 (Tabela 1) produziram um produto de amplificação PCR sem o uso de aditivos solventes, quando o ADN genómico de A. brasilense foi usado um s um modelo (Figura 1). Os efeitos do DMSO a 1,25%, 2,5%, 5,0%, 7,5%, e 10%, (p/vol) bem como formol em concentrações semelhantes às dos aditivos em PCR foram testados pela primeira vez (Figura 1). Também foi realizado um conjunto de PCR com BSA em 1-10 μg/μl (dados não mostrados). Consistente com os dados da literatura, enquanto tanto o DMSO como a adição de formol em PCR promoveram um maior rendimento da amplificação dos fragmentos de ADN de 2-3 kb, o efeito de reforço do DMSO foi maior do que o do formol (Figura 1). Nestas condições, observámos também que o aumento da concentração de DMSO poderia também levar a uma diminuição da especificidade da PCR (Figura 2). Por outro lado, o efeito do formol em promover um aumento da produção de PCR diminuiu para fragmentos de ADN superiores a cerca de 2,5 kb (Figura 1). Não houve efeito significativo de adicionar BSA sozinho como aditivo PCR, sob estas condições, incluindo nenhum efeito prejudicial (Dados não mostrados). Os efeitos potenciadores da BSA na produção de PCR foram detectados quando utilizada em combinação com DMSO ou formol, numa vasta gama de tamanhos de fragmentos de ADN (Figura 2). Além disso, a adição de BSA ampliou a gama de concentrações para as quais o solvente orgânico poderia ser adicionado, mesmo para modelos de DNA de tamanhos maiores (Figura 2). O consenso da literatura atual sobre formol indica que ele é mais eficaz como aditivo PCR quando usado em concentrações que variam de 0 a 5%, com a eficácia caindo completamente a 10% . Os nossos resultados indicam que, na presença de BSA, a formamida é eficaz pelo menos até 10% e com modelos de ADN até 2,5 kb de tamanho (tlp2); contudo, não conseguiu promover a amplificação de fragmentos de ADN de tamanhos maiores (Figura 1). Este resultado é consistente com o efeito relatado do formol como sendo mais eficiente para amplificações de modelos de ADN até cerca de 2,5 kb e apoia ainda mais a noção de que o DMSO e o formol melhoram o rendimento da PCR através de diferentes mecanismos. Independentemente dessas diferenças, a adição de BSA a essa PCR pareceu promover e expandir ainda mais os efeitos benéficos observados quando um dos dois solventes foi usado como aditivo para PCR. Dados os potenciais efeitos negativos que concentrações elevadas de solventes orgânicos podem ter em aplicações sensíveis a jusante, tais como sequenciamento ou clonagem, o efeito de melhoria da adição de BSA é significativo. A fim de obter uma visão de como o BSA pode agir como um co-enhancer com DMSO ou formol, analisamos o efeito da sua adição no rendimento da amplificação durante 10, 15, 20, 25 e 30 ciclos de PCR. Esta análise confirmou que a adição de DMSO ou formol, mas não apenas de BSA, à PCR leva a um aumento no rendimento (Figura 3). Quando a BSA foi usada como co-enhador com DMSO ou formamida, um aumento na produção pôde ser detectado nos primeiros 15 ciclos apenas para todos os modelos (Figura 3). Esse aumento variou de um aumento de 10,5% (che1P) no rendimento até um aumento de 22,7% no rendimento (cheA1) ao longo dos primeiros 15 ciclos. Além disso, verificou-se que a concentração efetiva de BSA aumentou com o tamanho do fragmento de DNA amplificado até uma concentração máxima de BSA (10 μg/μl) onde não foi detectado mais nenhum aumento na produção. Além disso, não foi observada qualquer diminuição na produção, mesmo com a maior concentração de BSA adicionada sob estas condições (Figura 4). O efeito de melhoramento do BSA no rendimento da PCR sugeriu que esta proteína pode desnaturar-se com o tempo, perdendo assim a sua eficácia. Para testar esta hipótese foi estabelecida uma PCR na qual o DMSO ou formol foi combinado com BSA no tampão de reacção inicial nas concentrações mais eficazes determinadas acima, e funcionou durante 10 ciclos antes da adição de solução fresca de BSA (0-10 μg/μl concentração final). A adição de BSA foi repetida durante 30 ciclos de PCR e o efeito no rendimento foi analisado como descrito acima. Foi possível detectar um aumento sustentado na produção quando o BSA foi adicionado a cada 10 ciclos de PCR: por exemplo, na amplificação de cheA1, foi obtido um aumento de quase 75% na produção de PCR sobre a obtida apenas com solvente (Figura 4). Os resultados observados no que denominamos “etapa de PCR do BSA” são consistentes com a suposição de que a desnaturação do BSA causa a queda no efeito de melhoramento do campo após o décimo quinto ciclo de PCR. As experiências de controlo em que foi adicionado glicerol ou água estéril destilada a cada décimo ciclo não aumentaram o rendimento da PCR, indicando que os efeitos do BSA não se devem a uma alteração no volume de reacção ou ao BSA actuar efectivamente como um crowder molecular, uma propriedade atribuída a alguns dos efeitos do glicerol em PCR . Embora os mecanismos exatos do efeito de aumento do BSA no rendimento da PCR não sejam conhecidos, os dados aqui obtidos e descritos na literatura suportam a hipótese de que o BSA pode estabilizar a DNA polimerase e/ou neutralizar os potenciais efeitos inibidores de altas concentrações de solventes orgânicos na atividade da DNA polimerase. Para amplificação de cheA4, o fragmento de DNA com maior conteúdo de GC usado neste estudo (73%), um aumento no rendimento da PCR foi obtido pela adição de BSA bem como DMSO à PCR, mas também foram detectados múltiplos produtos de amplificação não específicos (Figura 5). Para resolver este problema, o método de etapa de PCR BSA foi usado em seguida em combinação com um protocolo de PCR “Touchdown”, que mostrou anteriormente melhorar a especificidade da PCR . Este método produziu uma única banda específica, e quase duplicou o rendimento que foi produzido usando o protocolo “Touchdown” mais solventes orgânicos apenas (aumento de 96%) (Figura 5). Estes resultados também nos sugeriram uma forma de melhorar a eficiência relativamente baixa do uso do método de mutagênese direcionada ao sítio plasmídeo inteiro descrito no QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit (Stratagene) para introduzir mutação em algum modelo de DNA rico em GC (aqui o gene tlp2, um fragmento de 2,5 kb de 66% de GC). Quando usamos o pUCtlp2 como modelo para a mutagênese dirigida ao local, juntamente com os primers mutagênicos projetados para introduzir uma substituição de um único par de base dentro do tlp2 (primers mutagênicos projetados por site do fabricante) e o protocolo do fabricante, o fragmento de 5.324 kb correspondente ao pUCtlp2 era pouco visível (Figura 5). Ao completar o protocolo de mutagênese de acordo com as instruções do fabricante, não foi obtida nenhuma colônia ou um pequeno número de colônias (menos de 5 em média) que continham plasmídeos parentais que não apresentavam a mutação desejada. Este tipo de resultado, caracterizado por um fraco rendimento de mutagénese, foi previamente reconhecido como uma armadilha comum deste método. Entretanto, quando o BSA foi suplementado ao tampão de fabricação a cada cinco etapas, um produto claramente amplificado foi detectado (Figura 5). Após a conclusão do protocolo do fabricante, mais de 100 colônias com 2/3 carregando a mutação desejada (determinada pelo sequenciamento) foram obtidas. Também aplicamos a etapa PCR BSA em um protocolo de extensão de sobreposição para construir uma fusão da proteína quimérica entre um gene A. brasilense (ATM, 650 bp) e a proteína fluorescente cian (CFP) (720 bp). Na extensão de sobreposição PCR, 2 conjuntos de pares de primers são usados primeiro para amplificar dois fragmentos de DNA a serem fundidos que são produzidos com uma curta sequência de sobreposição um com o outro. Uma terceira amplificação usa os produtos de amplificação das primeiras reacções como modelos, juntamente com os primers mais exteriores de inversão e de avanço para gerar construções quiméricas. A amplificação dos dois fragmentos de ADN iniciais, ATM e CFP foram muito eficientes usando protocolos PCR padrão e nenhum aumento significativo pôde ser obtido usando o protocolo BSA PCR Step (Dados não mostrados). Contudo, o segundo passo de PCR em sobreposição, produziu numerosos produtos de amplificação não específicos e pouco, ou nenhum, amplicon quimérico desejado (ATM-CFP; Tabela 1) (Figura 5). Os produtos de amplificação não específicos desapareceram, quando se utilizou um método de PCR “Touchdown”, mas o amplicon quimérico específico desejado permaneceu em quantidade muito baixa, como detectado por uma banda ATM-CFP de 1,370 bp muito fraca (Figura 5). Usando o método BSA PCR Step juntamente com um protocolo “Touchdown”, resultou em um aumento de 72% no rendimento do amplicon quimérico ATM-CFP (Figura 5). A clonagem e sequenciação subsequentes confirmaram que a construção quimérica correcta foi obtida.
Efeitos do DMSO e formamide na amplificação PCR de modelos ricos em GC. Exemplos típicos dos efeitos da adição de DMSO e formol em diferentes concentrações na amplificação PCR de modelos de ADN ricos em GC de 2-3 kb. A) Efeito do DMSO na amplificação PCR de che1P (superior) e tlp2 (inferior) como observado pela electroforese em gel do total de produtos PCR. Os géis foram corados com brometo de etídeo e fotografados. B) Efeito do formol na amplificação de che1P (topo) e tlp2 (fundo) em experiências comparáveis.
PCR efeito de aumento de rendimento de BSA como usado como co-aditivo com solventes orgânicos. Exemplos típicos dos efeitos do BSA como co-aditivo com DMSO e formol, em diferentes concentrações, na amplificação por PCR de modelos de ADN ricos em GC. A) Efeito do DMSO na PCR do che1P (esquerda) e efeito combinado do DMSO com 6 μg/μl BSA (direita) como observado pela electroforese em gel do produto total da PCR. B) Efeitos do formol na amplificação PCR do che1P (esquerda) e efeito combinado do formol com 6 μg/μl BSA (direita) em experiências comparáveis.
Efeito da adição de BSA como co-enhancer com solventes orgânicos no rendimento da PCR. O aumento do rendimento em PCR é expresso em relação ao rendimento em PCR obtido sem qualquer aditivo. Em todos os painéis, aplica-se a seguinte legenda: linha vermelha, DMSO (7,5%) apenas; linha verde, formide (2,5%) apenas; linha roxa, DMSO (7,5%) e BSA (6 μg/μl); azul claro, formide (2,5%) e BSA (6 μg/μl). A) amplificação PCR de che1P (392 bp); B) amplificação PCR de tlp5P (798 bp); C) amplificação PCR de tlp2 (2.638 bp); D) Amplificação PCR do cheA1 (3.389 bp); E) Amplificação PCR do cheOP1 (7.103 bp).
Efeito do BSA como co-aditivo com solventes orgânicos quando suplementado nos passos intermédios da PCR. A) Efeito da adição de BSA no rendimento da PCR quando adicionado a cada dez ciclos para fragmentos de ADN de ampla gama de tamanho (392 bp a 7.103 bp); B) Exemplo representativo do efeito da adição de BSA na amplificação PCR de cheA1 (3.389 bp) na presença de DMSO, como detectado pela análise de fragmentos de ADN amplificados por electroforese em gel.
Efeito do BSA como co-aditivo com solventes orgânicos em várias aplicações de PCR. A) Um exemplo representativo do efeito da adição de BSA (BSA Step) como co-enhancer do efeito de DMSO na amplificação PCR de cheA4 num protocolo PCR “Touchdown”, tal como detectado por electroforese em gel. B) Um exemplo representativo do efeito do protocolo BSA Step usado na mutagénese dirigida ao local (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) amplificação PCR do pUCtlp2, tal como detectado pela Electroforese em gel. C) Um exemplo representativo do efeito do protocolo BSA Step usado em uma aplicação PCR de extensão sobreposta, fundindo ATM com CFP para render ATM-CFP, como detectado por Electroforese em gel.