Abstract
Estudos anteriores demonstraram que o fornecimento de colina está directamente ligado à obesidade induzida por dietas gordurosas elevadas e à resistência à insulina em ratos. O objetivo deste estudo foi avaliar se o fornecimento de colina também poderia modular a obesidade e a resistência à insulina causada por um defeito genético. Ratos machos ob/ob de oito semanas de idade foram alimentados durante dois meses com uma dieta deficiente em colina ou com suplemento de colina. Foi avaliado o peso dos tecidos, incluindo a massa gorda e a massa magra. Foram também investigados sinais intracelulares, glucagon plasmático e insulina e testes de tolerância à glicose e insulina. A dieta pobre em colina retardou o ganho de peso corporal e diminuiu a massa gorda. A deficiência de colina também diminuiu o nível plasmático de glicose e melhorou a tolerância à glicose e à insulina, embora o fígado adiposo tenha sido exacerbado. Aumento da atividade lipolítica adiposa, diminuição do glucagon plasmático e redução da expressão do receptor de glucagon hepático também foram observados com a dieta deficiente em colina. Os nossos resultados demonstram que uma dieta pobre em colina pode diminuir a massa adiposa e melhorar a tolerância à glicose em ratos obesos e diabéticos causada por um defeito genético.
1. Introdução
A colina é um factor dietético importante, que está envolvido em alguns processos cruciais como a biossíntese do neurotransmissor acetilcolina e o componente principal da membrana fosfatidilcolina (PC) . O PC pode ser sintetizado pela via CDP-colina ou pela metilação da fosfatidilanolamina pela fosfatidilanolamina N-metiltransferase (PEMT). A via PEMT é apenas quantitativamente significativa no fígado. A colina é também um precursor essencial do neurotransmissor acetilcolina, que age através dos receptores de acetilcolina muscarínicos e nicotínicos. Nos últimos anos, uma possível ligação entre a colina e a obesidade/diabetes tornou-se aparente . O potencial dos receptores de acetilcolina muscarínica como um alvo terapêutico da obesidade tem sido proposto . Recentemente, descobrimos que a deficiência de PEMT poderia proteger os ratos da obesidade induzida por dietas gordurosas e da resistência à insulina. No entanto, esta protecção desapareceu quando uma dose elevada de colina foi adicionada à dieta rica em gorduras. O caminho do PEMT seguido pelo catabolismo do PC é o único caminho biossintético conhecido para a colina em mamíferos . Uma diminuição significativa do conteúdo de colina em vários tecidos foi encontrada em ratos com deficiência de PEMT (Li et al., dados não publicados), fornecendo uma ligação direta entre a colina e a obesidade/resistência à insulina induzida por dietas gordurosas. No estudo atual, alimentamos ratos ob/ob com uma dieta deficiente em colina (DC) para avaliar se a deficiência de colina também poderia modular a obesidade genética e a resistência à insulina.
2. Material e Métodos
2.1. Animais e Dieta
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais da Universidade de Alberta, de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Ratos machos ob/ob de 8 semanas do The Jackson Laboratory foram aclimatados por 1 semana. Foram utilizados 5 ratos em cada grupo. Os ratos tiveram acesso livre a dietas com deficiência de colina (CD) ou com suplemento de colina (CS) durante 2 meses. A dieta CD (MP Biomedicals Canada, catálogo nº 901387) continha 20% de gordura como banha. A dieta CS consistiu na dieta CD à qual foi adicionado 0,4% (p/p) de cloreto de colina. Ratos foram sacrificados por anestesia com isoflurano, seguido por punção cardíaca.
2.2. Ganho de peso corporal, massa magra e medida de massa gorda
O peso corporal foi medido semanalmente. A massa magra e a massa gorda foram analisadas, 2 meses após os ratos terem sido colocados em dieta (premortem), utilizando o sistema EchoMRI.
2.3. Teste de tolerância à glicose e insulina
Teste de tolerância à glicose: após um jejum de 12 horas, os ratos receberam uma injeção intraperitoneal (i.p.) de 0,5 g de dextrose/kg de peso corporal dissolvida em solução salina tampão fosfato esterilizado (PBS). Teste de tolerância à insulina: após um jejum de 6 horas, os ratos receberam uma injeção i.p. de 1,0 unidade de insulina (Sigma)/kg de peso corporal em PBS. As concentrações de glicose no sangue foram medidas por um glicosímetro em sangramentos de cauda antes e em momentos indicados após a injeção.
2.4. Medidas do complexo mitocondrial I/II Atividade
As atividades do complexo mitocondrial I e II foram determinadas pelo uso de proteína mitocondrial. Resumidamente, para isolar a proteína mitocondrial, as amostras foram mantidas em gelo e homogeneizadas em um tampão contendo 75 mM de sacarose, 225 mM de sorbitol, 1 mM de EGTA, e 0,1% de albumina de soro bovino livre de ácidos graxos em 10mM de Tris-HCl pH 7,4. O homogeneizado foi centrifugado a 600× g durante 15 min, e o sobrenadante resultante foi ainda centrifugado durante 20 min a 16.200 rpm. A proteína mitocondrial nos pellets foi suspensa em um tampão contendo 20 mM Tris e 25 mM Sacarose (pH 7,4) e mantida a -80°C até ser utilizada. A medição da atividade foi realizada em um espectrofotômetro por um período de 5min como uma diminuição da absorção a 600nm devido à redução de 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP) para ubiquinona-1 na presença de NADH (substrato do complexo I) ou succinato (substrato do complexo II) em conformidade. A reação foi realizada na presença de antimicina e cianeto de potássio como inibidor do complexo III e do complexo IV. Rotenona, como inibidor do complexo I, também foi envolvida no tampão de reação para atividade do complexo II.
2,5. Histologia e Imunoblotting
Para histologia, os fígados ou almofadas de gordura foram dissecados em formaldeído a 10% em PBS, seguido pela rotina de coloração de hematoxilina e eosina. Para imunoblotting, após a homogeneização e centrifugação a 600× g das amostras hepáticas, os sobrenadantes resultantes foram submetidos à determinação da concentração de proteínas (BioRad) para garantir que igual quantidade de proteínas fosse carregada à SDS-PAGE. Todos os anticorpos primários contra lipase sensível a hormonas (fosfo-HSL/total HSL), fosfoenolpirruvate carboxiquinase (PEPCK), acetil-CoA carboxilase (fosfo-ACC/total ACC), e proteína quinase activada por AMP (phospho-AMPK/total AMPK) são comprados à Cell Signaling. Anticorpos para a desidrogenase piruvada isozyme 4 (PDK4), receptor glucagon foram obtidos da Abcam, mas supressores da sinalização de citocinas 3 (SOCS3) e PGC-1α foram obtidos da Santa Cruz Biotecnologia.Tublin ou actina foram usados como controles de carga para normalização. A imagem foi analisada pelo software ImageJ.
2.6. Plasma Insulin and Glucagon Measurement
As medidas foram realizadas usando um mouse/rat glucagon, insulin assay kit (Meso Scale Discovery) baseado nas instruções da empresa.
2.7. Análise estatística
Os dados são mostrados como média ± SD. As diferenças foram avaliadas utilizando o teste t do aluno. Um valor de 𝑃<0,05 foi considerado significativo.
3. Resultados
A dieta deficiente em álcool diminuiu significativamente o ganho de peso corporal até 2 meses (Figura 1(a)) sem influenciar o consumo de alimentos (ingestão diária de alimentos 7,21±1,23 g para ratos com CD versus 7,39±1,31 g para ratos com CS, 𝑃>0,05). Houve diferença significativa no peso corporal inicial entre dois grupos (30,42±1,70 g para ratos com DC versus 26,3±2,26 g para ratos com SC, 𝑃=0,01). A deficiência de colina não influenciou o peso do coração, fígado ou rim (Figura 1(b)), mas houve uma diminuição significativa no peso da gordura epidídima e perirrenal (Figura 1(c)). Análises posteriores, usando ressonância magnética, mostraram que a deficiência de colina diminuiu a massa gorda corporal total e ainda aumentou a massa magra, não importando se expressa como massa absoluta ou percentagem relativa à massa corporal total (Figura 1(d)). A deficiência de colina aumentou a expressão da lipase adiposa tecidual sensível ao fosfósforo, uma forma ativada da enzima (Figura 1(e)). A deficiência de colina, por outro lado, não alterou a morfologia do tecido adiposo (Figura 1(f)).
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Besides influenciando o peso corporal, a deficiência de colina também diminuiu a glicemia plasmática em jejum (14,3±1,67 versus 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) e o nível de glucagon (Figura 2(a)), embora não tenha tido efeito no nível de insulina plasmática (Figura 2(b)). Uma melhora significativa da glicose e da intolerância à insulina foi observada em ratos com dieta pobre em colina (Figuras 2(c)-2(d)). Para investigar o mecanismo subjacente, foram analisadas as principais enzimas de oxidação da glicose. A deficiência de colina reduziu a expressão da proteína hepática do PDK4 (Figura 3(a)), um regulador negativo da atividade da piruvato desidrogenase que controla o influxo de acetil-CoA mitocondrial, o que indica uma melhor utilização da glicose. Similarmente, o PGC-1α hepático (um conhecido modulador a montante do PDK4) e o PEPCK (um alvo a jusante do PGC-1 α e uma enzima chave para gluconeogênese) foram reduzidos (Figura 3(b)), sugerindo uma diminuição da gluconeogênese. Além disso, investigamos se a melhora da glicose e da intolerância à insulina poderia estar associada à alteração da inflamação hepática e da função mitocondrial. Nem a expressão proteica de SOCS3 (Figura 3(c)), um marcador de pró-inflamação, nem a atividade do citrato sintetase mitocondrial foram afetadas (dados não mostrados). Entretanto, a atividade do complexo mitocondrial II, mas não do complexo I, foi significativamente diminuída pela deficiência de colina (Figura 3(d)). De interesse, a expressão protéica do receptor glucagon hepático também foi diminuída pela deficiência de colina (Figura 3(e)).
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Choline-A dieta deficiente melhora a intolerância à glicose e à insulina. Os camundongos obesos e ob/obbs de 8 semanas tiveram acesso livre a dietas de CD ou CS durante 2 meses. Foi medido o nível de glucagon plasmático (a) e insulina (b) de jejum. O teste de tolerância à glicose intraperitoneal (c) e o teste de tolerância à insulina (d) foram realizados. ∗∗𝑃<0,01 e ∗𝑃<0,05 quando comparado ao grupo de CS.
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Mecanismos moleculares envolvidos na melhoria da sensibilidade insulínica em ratos ob/ob sobre colina…dieta deficiente. Os camundongos ob/ob que tinham 8 semanas de vida tiveram acesso livre a dietas de CD ou CS durante 2 meses. A expressão da proteína hepática PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c), e receptor glucagon (e) foi testada por immunoblotting. As atividades dos complexos mitocondriais I e II também foram medidas (d). ∗𝑃<0,05 quando comparado ao grupo CS.
Embora melhorando a tolerância à glicose, a deficiência de colina exacerba a gordura hepática, suportada pela análise histológica e aumento da massa de triglicérides hepáticos (Figura 4(a)). Para compreender os mecanismos subjacentes ao fígado gorduroso induzido pela deficiência de colina, analisámos as enzimas envolvidas no ácido gordo β-oxidação e lipogénese. A deficiência de colina aumentou a atividade da glicerol-3-fosfoaciltransferase hepática (GPAT) (Figura 4(b)) e diminuiu a atividade da β-hidroxiacil-CoA desidrogenase (β-HAD) (Figura 4(c)), uma enzima chave do ácido graxo β-oxidação, o que indica que mais ácidos graxos intracelulares foram canalizados para a biossíntese lipídica em vez da oxidação. Esta noção foi ainda apoiada por uma diminuição na expressão de fosfo-AMPK e fosfo-ACC hepáticos (Figura 4(d)), que então ativa o ACC e melhora a lipogênese hepática.
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Mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento de fígado gorduroso em ratos ob/ob sobre colina…dieta deficiente. Os camundongos ob/ob que tinham 8 semanas de vida tiveram acesso livre a dietas de CD ou CS durante 2 meses. Os cortes hepáticos foram corados com H & protocolo de coloração E, e a quantidade de triglicérides hepáticos foi medida (a). Foram testadas as atividades de glicerol-3-fosfato-aciltransferase (GPAT) (b) e β-hidroxil acyl-CoA desidrogenase (β-HAD) (c). A expressão proteica do fosfo-AMPK e do fosfo-ACC foi monitorizada (d). ∗𝑃<0,05 quando comparado ao grupo CS.
4. Discussão
Em trabalhos anteriores, demonstramos que a suplementação com colina está ligada à obesidade induzida por dietas altas e à resistência à insulina em ratos com deficiência de PEMT. Recentemente, descobrimos que a resistência à insulina induzida pela colina é específica da colina, não apenas em ratos do tipo selvagem, mas também em ratos com deficiência de PEMT (Wu e Vance et al. dados não publicados). No presente estudo, investigamos o impacto da privação de colina em camundongos ob/ob. Demonstramos cinco novos efeitos da deficiência de colina: (1) aumento da atividade lipolítica adiposa; (2) melhora da oxidação da glicose; (3) diminuição da oxidação dos ácidos graxos hepáticos; (4) diminuição da expressão dos receptores de glucagon hepático; (5) redução da atividade do complexo mitocondrial II hepático.
4.1. Deficiência de colina Atenua o ganho de peso corporal
A deficiência de colina atenua significativamente a obesidade induzida por dietas elevadas de gordura em ratos Pemt-/- e o ganho de peso em ratos ob/ob. No entanto, Raubenheimer et al. relataram que a deficiência de colina não afetou o ganho de peso ou o peso do tecido adiposo. A diferença entre dois estudos pode ser devida a diferenças nos modelos animais e nos protocolos de alimentação. No estudo de Raubenheimer, os ratos C57Bl/6 foram alimentados com uma dieta rica ou pobre em gordura durante 8 semanas, mas os ratos só receberam a dieta CD ou CS durante as últimas 4 semanas. Nossos ratos ob/ob foram alimentados com a dieta com alto teor de gordura CD ou CS por 8 semanas. Na literatura, tanto os ratos ob/ob como as fêmeas têm sido amplamente utilizados em estudos metabólicos, como o ganho de peso corporal e a sensibilidade à insulina hepática (e muscular), e não foi relatado nenhum efeito significativo de gênero. Em nosso estudo, apenas ratos ob/ob foram utilizados.
Nosso estudo atual demonstra que a colina também pode modular a obesidade genética derivada da obesidade. Como a deficiência de colina não influenciou o consumo de alimentos, o aumento da atividade lipolítica adiposa (aumento da expressão da lipase sensível ao hormônio ativo) pode explicar a redução da massa gorda e o ganho de peso corporal. Além disso, não podemos excluir as possibilidades de que a deficiência de colina possa aumentar o gasto energético ou a expressão de UCP1 no tecido adiposo marrom e UCP2/UCP3 no músculo esquelético, que são fatores potenciais que contribuem para a diminuição do ganho de peso corporal .
4,2. Deficiência de colina melhora a tolerância à glicose
Em contraste com a suplementação com colina, que está ligada à resistência à insulina induzida por dietas altas de gordura em ratos , a deficiência de colina melhora a tolerância à glicose em ratos ob/ob. Isto é consistente com o estudo de Raubenheimer, onde ratos com C57Bl/6 em uma dieta com alto teor de gordura CD diminuíram os níveis de insulina e melhoraram a tolerância à glicose em comparação com a dieta com alto teor de gordura suplementada com colina . O glucagon plasmático elevado é normalmente encontrado em pacientes diabéticos do tipo 2. A injeção de colina aumentou os níveis de insulina plasmática e de glucagon em ratos . Por outro lado, a deficiência de colina em nosso estudo diminuiu o glucagon plasmático e diminuiu a expressão do receptor de glucagon. Como nos últimos anos foram propostos antagonistas do receptor glucagon como potenciais drogas terapêuticas para diabetes tipo 2, a diminuição da expressão proteica do receptor glucagon em camundongos ob/ob em dieta deficiente em colina, até certo ponto, pode explicar a melhora da tolerância à glicose. A diminuição da expressão do PGC-1α hepático foi concomitante com uma diminuição da regulação de PEPCK e PDK4, indicando uma diminuição da produção de glicose e aumento da oxidação da glicose. A down-regulation do β-HADH sugeriu uma diminuição da oxidação de ácidos graxos. Estes processos foram acompanhados por uma diminuição da atividade do complexo mitocondrial II, o que pode refletir uma resposta compensatória à redução do estresse oxidativo mitocondrial. Assim, a tolerância à glicose CD-improduzida foi devida à diminuição da produção de glicose hepática e ao aumento da utilização de glicose. Isto poderia ocorrer através da supressão do receptor glucagon hepático, que regula a AMPK via adenilato ciclase, modulando assim a PGC-1α e seus alvos a jusante, como PEPCK e PDK4, bem como a capacidade de transporte de elétrons mitocondriais hepáticos. Assim, são necessárias mais investigações para provar se o receptor glucagon pode ser um novo alvo terapêutico para a diabetes.
4.3. A desconexão entre o fígado gordo e a resistência à insulina
Fígado gordo demonstrou ser um preditor independente da obesidade da diabetes tipo 2. Pensa-se que o aumento dos ácidos gordos intracelulares tem um papel causal na resistência à insulina hepática. No estudo atual, a deficiência de colina exacerbou o fígado gorduroso, no qual se observou uma diminuição na atividade de β-hidroxiacetil CoA desidrogenase e um aumento na atividade de glicerol palmitoyl-acyl transferase, sugerindo um papel da colina na modulação do metabolismo dos ácidos graxos. Assim, o redirecionamento dos ácidos graxos para o armazenamento de triglicerídeos hepáticos pode ser um mecanismo inicial de proteção para diminuir as concentrações de ácidos graxos intracelulares hepáticos. A deficiência de colina a longo prazo, porém, está ligada à hepatoesteatose, ao risco de defeito do tubo neural, bem como ao risco de câncer e à perda de memória, o que pode limitar o uso de uma dieta pobre em colina como estratégia terapêutica a longo prazo para a obesidade e resistência à insulina.
Em conclusão, a deficiência de colina pode prevenir o ganho de peso corporal e melhorar a tolerância à glicose em ratos ob/ob. A restrição modesta da ingestão de alimentos ricos em colina pode beneficiar os pacientes obesos, pré-diabéticos e diabéticos. Nossos resultados sugerem novas abordagens terapêuticas possíveis.
A abreviações
| PC: | Fosfatidilcolina |
| PEMT: | Fosfatidilanolamina N-metiltransferase |
| CD: | Deficiente deholine |
| CS: | Suplemento deholine |
| HSL: | Lipase sensível a hormonas |
| PEPCK: | Carboxilase fosfogenolpiruvada |
| ACC: | Acetil-CoA Carboxilase |
| AMPK: | AMP-activated protein kinase (AMPK) |
| PDK4: | Pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4 |
| SOCS3: | Suppressor de sinalização de citocinas 3 |
| GPAT: | Glycerol-3-fosfo-acyltransferase. |
Contribuição dos autores
G. Wu e L. Zhang contribuíram igualmente.
Author Disclosure
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Confirmações
Este trabalho foi apoiado por um subsídio (MOP 89793) dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde.