Animals
S. purpuratus eram mantidos em água do mar artificial a 14 °C. L. anatina foram recolhidos em Junho de 2016 nas zonas húmidas de Xiangshan, Distrito de Xiangshan, Cidade de Hsinchu, Taiwan (coordenadas GPS 24.770779, 120.910742 E), transportados para o laboratório em gelo, e depois dissecados imediatamente.
Construções e plasmídeos
Para determinar a atividade enzimática de SpAIDLs e LaAIDLs, os respectivos vetores de expressão bacteriana pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID foram gerados para SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 e HsAID. Os quadros de leitura abertos de cada SpAIDL foram amplificados a partir do DNA genómico por PCR usando a Phusion polimerase e primários contendo sítios de restrição SpeI e XhoI (Tabela Suplementar 1). Os produtos PCR foram digeridos com SpeI e XhoI (New England Biolabs) e inseridos nos sítios NheI/XhoI do pASK-TadA (um presente da Dra. Nina Papavasiliou, Universidade Rockefeller, Nova Iorque) substituindo o quadro de leitura aberto TadA. Para SpAIDL9 esta estratégia de clonagem mudou o terceiro aminoácido de fenilalanina para serina, e esta mutação F3S foi revertida para F3 usando o Quikchange mutagenesis kit (Stratagene) com primers SPA9S3FT/SPA9S3FB (Tabela Suplementar 1). O HsAID foi amplificado a partir de um plasmídeo contendo AID humano de comprimento total (pCDF-AID, um presente da Dra. Nina Papavasiliou, Universidade Rockefeller, Nova Iorque). A estratégia de clonagem mudou o segundo aminoácido de aspartato para alanina, e D2A foi revertido para D2 usando o kit de mutagênese Quikchange (Stratagene) com primers hAIDA2DT/hAIDA2DB (Tabela Suplementar 1). A pASK vazia foi gerada pela digestão NheI/XhoI da pASK-TadA, preenchendo os overhangs com polimerase de Klenow, e ligadura com ligase de DNA T4 (Thermo Scientific). Os quadros de leitura aberta de cada LaAIDL foram amplificados a partir de L. anatina cDNA e clonados no vector de clonagem pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Os quadros de leitura aberta de LaAIDLX foram excisados com SpeI e XhoI (New England Biolabs), e clonados nos sítios XbaI/XhoI do pASK_V5-SpAID4a (descritos abaixo), substituindo a inserção de SpAID4a. Deve-se notar que os fragmentos clonados contêm os códons de parada originais em suas extremidades 3′, de modo que a proteína expressa não contém uma tag V5.
A expressão constrói para os mutantes locais ativos de SpAIDL1 e LaAIDL1 (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, e LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) foram gerados por mutagênese dirigida ao local a partir dos respectivos plasmídeos do tipo selvagem (ou mutante simples) usando o kit de mutagênese Quikchange (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB para SpAIDL1 RQ), ou por PCR convencional, usando os iniciadores fosforilados 5′ (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB para o segundo conjunto de alterações em SpAIDL1 RQAA, e LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P e LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P para SpLaAIDL1 RQRQ) seguido de digestão DpnI, ligadura para circular os produtos e transformação em E competente. coli.
Para monitorar o nível de expressão da proteína recombinante na E. coli, a expressão bacteriana constrói pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID. pASK_V5 foi gerada pelo recozimento dos oligonucleotídeos pASK_V5F/pASK_V5R (Tabela Suplementar 1) contendo a seqüência de tags V5, e ligando-os nos sites NheI/SalI da pASK-TadA. Os plasmídeos pASK-SpAIDLX/LaAIDLX foram utilizados como modelos para amplificar os respectivos cDNAs sem códon de parada, utilizando a polimerase de Phusion e os primers listados na Tabela Suplementar 1, e clonados nos sítios NheI/XhoI (para fragmentos de SpAIDLX e HsAID) ou XbaI/XhoI (para fragmentos de LaAIDLX) do pASK_V5. HsAID foi amplificado a partir do pASK-hAID. As sequências de ambos, SpAIDL9 e HsAID, foram novamente alteradas por esta estratégia de clonagem, e foram alteradas de volta para as sequências correctas como descrito acima.
Preparação de DNA genómico
DNAs genómicos de ambos, S. purpuratus e L. anatina, foram purificados usando o gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, aproximadamente 1 × 106 S. purpuratus coelomocytes e 100 mg L. anatina foram adicionados a tubos de microcentrifugação separados, homogeneizados em 200 µl de tampão GT (Bioman) contendo 200 mg de Proteinase K, e incubados durante 30 min a 60 °C para lisar completamente as células. Após a adição de 200 µl de tampão BG (Bioman), as amostras foram vortexadas e incubadas durante 20 min a 70 °C. Posteriormente foram adicionados 200 µl de etanol e toda a amostra foi carregada em uma coluna de spin GD (Bioman). Lavagens com 400 µl de tampão WI (Bioman) e 600 µl de tampão de lavagem foram realizadas por centrifugação a 10.000×g durante 30 s. Isto foi seguido pela eluição dos DNAs genómicos com 100 µl de tampão de eluição (10 mM Tris pH = 8,0) que foi pré-aquecida a 60 °C.
RNA preparação e síntese de cDNA
S. purpuratus fluido coelômico foi aspirado com uma seringa através da membrana periostomal e misturado imediatamente com um volume igual de CMSFW-EI (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidazol). Os coelomócitos foram fiados e ressuspensos em 800 μl Reagente RNA Total EasyPure (Bioman). O esôfago, intestino delgado, intestino grosso e gônadas de S. purpuratus e o pedículo, ceco digestivo, gônada e intestino de L. anatina foram dissecados a partir de animais individuais. Pequenos pedaços dos tecidos sólidos de S. purpuratus e L. anatina foram adicionados a 200 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman), e as amostras foram homogeneizadas em um Bullet Blender (Next Advance) usando contas ZrO de 0,5 mm. Os detritos insolúveis foram fiados e os sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos contendo 600 μl Reagente de RNA EasyPure Total (Bioman) e 200 μg glicogênio como portador. O RNA total foi então purificado de acordo com o protocolo do fabricante. Para remover o gDNA residual e outros contaminantes, o S. purpuratus RNA foi então processado usando o kit Turbo sem DNA (Ambion) ou o mini kit RNeasy (Qiagen). O kit Turbo sem DNA (Ambion) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante, excepto que foram adicionados MgCl2 (2,5 mM) e CaCl2 (1 mM) extra para a digestão do DNase. O mini-kit RNeasy (Qiagen) foi usado de acordo com o protocolo do fabricante.
Aproximadamente 250-500 ng de S. purpuratus e L. anatina RNA de cada tecido foram convertidos para cDNA usando o sistema ThermoScript RT-PCR (Invitrogen) ou o kit ToolsQuant II Fast RT (Biotools), respectivamente. Em ambos os casos foram utilizados hexamares aleatórios e as instruções do fabricante foram seguidas.
Amplificação rápida de pontas de cDNA
As pontas 5′ e 3′ das transcrições do SpAIDL9 foram amplificadas usando o SMARTer RACE kit (Clontech) e os primers específicos do gene SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (ver Tabela Complementar 2) de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos PCR contendo os extremos das transcrições 5′ e 3′ foram clonados no vector de clonagem pJET1.2/blunt (Thermo Scientific), e os clones individuais foram sequenciados por completo.
Análise sequencial dos genes de SpAIDL
Genómico ADN de três S. Os indivíduos purpuratus (Sp105, Sp111, Sp112) foram usados como modelos para amplificar os quadros de leitura abertos de SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 usando a Phusion polimerase e os primers listados na Tabela Complementar 2. Os produtos PCR foram clonados no vector de clonagem pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Os plasmídeos foram purificados usando o Tools mini plasmid kit (Biotools) e submetidos a um serviço comercial (Genomics Taiwan) para seqüenciamento usando os primers pJET1.2 forward ou o pJET1.2 reverse.
Em pelo menos oito seqüências foram coletadas para cada gene de cada ouriço-do-mar, e as seqüências de primers foram excluídas para antes do alinhamento das seqüências. As seqüências nucleotídicas para cada gene foram primeiramente alinhadas dentro de cada S. purpuratus usando CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw), e as seqüências dominantes correspondentes aos dois alelos foram então selecionadas para posterior comparação entre os ouriços-do-mar individuais.
Análise da expressão do gene
A ADN complementar de três S. purpuratus individuais (Sp146, Sp147, Sp148) e dois L. anatina individuais (La1 e La3) foram usados como modelos para testar a expressão de SpAIDL1, 2, 3, 4a, e 9, ou LaAIDL1 e 2 por PCR quantitativa. Cada reacção qPCR (10 μl) continha 5 μl Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), primers (0.1 μM) (ver Tabela Complementar 3) e 1 μl de modelo, e para cada amostra foram preparadas duas réplicas técnicas. As reacções qPCR foram realizadas num Sistema Rápido de PCR em Tempo Real 7500 (Applied Biosystems), aplicando um passo inicial de desnaturação a 95 °C durante 20 s, seguido de 40 ciclos de 3 s a 95 °C e 30 s a 60 °C. Foram utilizadas curvas padrão para determinar os níveis de expressão dos genes e foram utilizados genes de manutenção (Sp18S para S. purpuratus e LaRPL39 para L. anatina) para normalização.
Modelo de infecção bacteriana
Vibrio diazotrophicus foram cultivados em culturas líquidas Difco marine broth (Becton Dickinson) a 30 °C e 250 rpm durante a noite. Seis ouriços-do-mar saudáveis foram selecionados aleatoriamente e divididos em dois grupos, um grupo experimental e um grupo controle. Alíquotas de fluido coelômico (0,5 ml) foram retiradas de cada animal a t = 0. Os ouriços-do-mar no grupo experimental foram injetados com uma suspensão de Vibrio diazotrophicus vivo em 200 µl de água do mar artificial estéril com a quantidade de bactérias ajustada para cada ouriço-do-mar para corresponder a 106 células/ml de volume total de fluido coelômico. O grupo controle foi injetado com 200 µl de água do mar estéril. Em t = 6, 24, e 48 h, 200 µl de fluido coelómico foi retirado de cada animal de cada grupo. O RNA foi extraído dos coelomócitos obtidos em cada ponto de tempo, e do t = 0 amostras de DNA genômico também foi preparado. Os pares de primer para análise de expressão gênica (Tabela Suplementar 3) foram primeiramente testados nas amostras de DNA genômico para assegurar que eles possam amplificar o respectivo gene de cada indivíduo, apesar dos notáveis níveis de polimorfismo em sua seqüência dentro da população de S. purpuratus (ver Fig. 1b). O RT-PCR quantitativo (como descrito acima) foi usado para medir os níveis de expressão gênica com pelo menos duas réplicas técnicas por amostra. Os valores de expressão foram primeiro normalizados para os níveis de 18S em cada amostra, e depois para os valores em t = 0 para cada animal. Três réplicas biológicas foram utilizadas para o grupo experimental e controle, e todos os pontos de dados foram mostrados.
ensaios de CDA com o relator de resistência a canamicina
Foi utilizado um protocolo otimizado de um ensaio amplamente utilizado para medir as atividades do CDA polinucleotídeo26. O plasmídeo pTAC-Kan deaminase repórter contendo uma mutação pontual L94P no gene KanR e vetores de expressão individuais pASK-SpAIDLX/LaAIDLX foram transformados sequencialmente na cepa BH156 E. coli deficiente em UNG. O vetor de expressão humano AID pASK-HsAID e o vetor vazio pASK serviram como controles positivos e negativos, respectivamente. Para o ensaio de deaminase, pelo menos oito colônias individuais para cada deaminase putativa foram cultivadas em caldo LB (contendo 50 μg/ml de ampicilina (Amp), 50 μg/ml de espectinomicina (Spc), e 17 μg/ml de cloranfenicol (Cam)) até a densidade óptica a 600 nm atingir 0,3. Cada cultura foi então dividida ao meio. Enquanto IPTG (1 mM) foi adicionado a ambas, anhydrotetracycline (AHT) (0.2 μg/ml) foi adicionado apenas a uma delas para induzir a expressão de SpAIDLX/LaAIDLX. Após incubação por 3 h a 37 °C e 200 rpm, as culturas foram fiadas, lavadas com PBS, e espalhadas em placas LB contendo 50 μg/ml de Amp, 50 μg/ml de Spc e 17 μg/ml de Cam, ou 50 μg/ml de Amp, 50 μg/ml de Spc, 17 μg/ml de Cam, e 30 μg/ml de Kanamicina (Kan). As frequências de reversão foram calculadas como a razão entre o número de colónias de KanR e o número total de colónias na placa Amp+Spc+Cam. A freqüência relativa de reversão foi então determinada como a razão das freqüências de reversão de um par de culturas de bactérias idênticas, nas quais a transcrição de KanR foi induzida com IPTG na presença ou na ausência de expressão de deaminase. Para confirmar que as colônias de KanR eram realmente resultado de desaminação de DNA, os plasmídeos pTAC-Kan de múltiplas colônias foram purificados e a reversão do códon de parada confirmada pelo seqüenciamento de DNA.
ensaios de CDA usando rpoB como repórter
Um protocolo otimizado de um ensaio amplamente utilizado para medir as atividades do CDA polinucleotídeo35 foi usado. Os vetores individuais da expressão pASK das deaminases invertebradas foram transformados separadamente em BH156 E. coli, deficiente em UDG. Quatro ml de culturas de meio LB contendo 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam, e 0,3 µg/ml AHT foram inoculados com colónias de bactérias únicas. As culturas foram cultivadas durante 24 h a 37 °C 230 rpm, as alíquotas foram plaqueadas em placas de ágar LB contendo 100 µg/ml Amp ou 100 µg/ml de rifampicina, e cultivadas a 37 °C durante a noite. As colónias foram contadas e as frequências de reversão foram calculadas como a razão entre os números de colónias RifR e os números de colónias AmpR da mesma cultura. As culturas que expressam HsAID ou que contêm o vector de expressão pASK vazio serviram como controlos positivos e negativos, respectivamente. Pelo menos oito culturas por construção de expressão foram testadas. Para determinar a identidade das mutações no gene rpoB das colónias resistentes à rifampicina, foram realizadas PCRs de colónias individuais a partir de 24 colónias usando a Phusion polimerase e o par de primers rpoBF/rpoBR. Os produtos PCR foram purificados em gel e submetidos a sequenciação usando o primer rpoBF. As mutações foram identificadas por comparação com a sequência WT (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797).
Expressão de proteínas de deaminases invertebradas em E. coli
Para monitorizar o nível de expressão de SpAIDLX/LaAIDLX nos ensaios de deaminase, pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX foram transformadas em BH156, deficiente em UNG. Colónias individuais foram cultivadas em caldo LB (contendo 50 μg/ml de Amp, 50 μg/ml de Spc, e 17 μg/ml de Cam) até a densidade óptica a 600 nm ser de 0,3. IPTG (1 mM) e AHT 0.2 (μg/ml) foram adicionados à cultura para induzir a expressão das proteínas. Após incubação durante 3 h (37 °C, 200 rpm), as culturas foram pelletizadas e lavadas com PBS. Os pellets foram lisados em 2x tampão de amostra SDS, diluídos dez vezes e separados em um par de géis com 10% de SDS-PAGE. Enquanto um gel foi corado com Coomassie blue para avaliar se quantidades iguais de proteínas foram carregadas, o outro gel foi transferido para membranas PVDF por transferência semi-seca e deaminases V5 foram detectadas usando um anticorpo primário anti-V5 de rato (Abcam, ab27671) e um antissoro secundário de coelho-anti-rato (Jackson ImmunoReasearch). Os sinais quimioluminescentes foram visualizados usando o Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) e filme de raios X ou um sistema de imagem ChemiDoc Touch (BioRad). Imagens não cultivadas de todos os géis de proteína corados e “western blots” são mostradas na Fig. 5 Suplementar. Todas as experiências de expressão bacteriana foram feitas em duplicado.
Bioinformática
As comparações de sequência com o genoma do ouriço-do-mar foram feitas usando BLAST, BLASTP, ou BLASTN em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ou www.echinobase.org usando parâmetros padrão ou com o filtro de baixa complexidade desligado. Alinhamentos sequenciais múltiplos foram realizados usando CLUSTALW e otimizados manualmente com base nas características estruturais secundárias previstas. Análises filogenéticas e moleculares evolutivas foram realizadas usando MEGA (versão 7)36.
Dados disponíveis
Dados de sequência que suportam os resultados deste estudo foram depositados no Genbank com os seguintes códigos de adesão: SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).