May 12, 2018
Uma pergunta comum que os cientistas fazem sempre quando recebem o sinal de um ensaio baseado em anticorpos é “Este sinal representa verdadeiramente a presença e quantidade da minha proteína?”
A especificidade de anticorpos é sempre uma preocupação para os cientistas. Embora existam vários métodos de validação que têm sido utilizados para os testes de especificidade, os dados são muitas vezes sobre-interpretados. Dados de pesquisa de vários grupos têm mostrado que os anticorpos monoclonais usados no mercado não são na verdade mono-específicos. E a reactividade cruzada pode enganar os investigadores com falsos resultados positivos, e potencialmente causar efeitos secundários inesperados e falsos relatórios de diagnóstico para os clínicos.
Então, quais são os controlos que devemos usar para a validação da especificidade dos anticorpos?
Linhas de células e tecidos que expressam as proteínas alvo em grandes quantidades podem ser usados como controlos positivos para a validação de anticorpos. No entanto, o controle positivo não será capaz de confirmar a especificidade do anticorpo. Você pode ver uma faixa no tamanho correto ou coloração positiva no local subcelular direito, mas todos eles podem ser falsos sinais positivos da reatividade cruzada do anticorpo. Assim, normalmente para validação de anticorpos, é necessário um controle negativo para a avaliação da ligação não específica.
A validação de Knockout é até agora o melhor controle negativo para a avaliação da especificidade dos anticorpos. Na validação de knockout, o anticorpo é testado numa linha de células knockout que não expressa a proteína alvo. A partir de 2017, OriGene se apressou com EdiGene, um inovador CRISPR, para produzir células knockout duplas de alta produção. Ao contrário da linha de células knockout da Horizon, as células OriGene knockout são das linhas celulares comumente usadas, como HEK293T ou HeLa, tornando o produto mais relevante para os pesquisadores. Nesta linha de células knockout dupla, o alvo anticorpos não está presente, pois o gene que codifica a proteína é eliminado ou “knocked out”. Amostras de células knockout e células parentais (tipo selvagem) são testadas lado a lado contra o mesmo anticorpo, e se o anticorpo for verdadeiramente específico, deve apenas detectar o sinal específico na célula tipo selvagem, mas não na linha de células knockoutcell. Utilizando os lisados destas células knockout, validámos mais de 100 anticorpos monoclonais (anticorpos KO validados). Acredita-se que a validação Knockout oferece um verdadeiro controle negativo para o teste de especificidade de anticorpos.
Mas a validação Knockout é suficiente para confirmar a mono-especificidade de um anticorpo? Eu guardaria esta conclusão com cautela.Antes de mais nada, os efeitos fora do alvo das células knockout não são bem estudados nesta fase. Então você poderia ter uma célula knockout não apenas eliminar a expressão de sua proteína de interesse, mas também eliminar ou reduzir a expressão de outra proteína, que pode ser uma proteína que reage cruzadamente com o anticorpo. Assim, o sinal negativo nem sempre significa que o anticorpo irá treinar com qualquer outra proteína, exceto com a proteína de interesse. Em segundo lugar, o teste com célula/tecido knockout só é possível para as proteínas não essenciais. Para as proteínas essenciais, o nocaute é impossível. Então, para essas proteínas, você precisará de outra forma de testar a especificidade do anticorpo.
Antes de anos atrás, a OriGene desenvolveu um método de matriz de proteínas para testes de especificidade de anticorpos. Com a maior coleção de lisados de superexpressão do mundo, fizemos um único chip de proteína que contém >10k proteínas humanas super-expressas em duplicata em uma única lâmina de vidro revestida de nitrocelulose. Esta tecnologia de proteinmicroarray tem sido usada para validar a especificidade de muitos anticorpos monoclonais OriGeneUltraMAB™. Ao aumentar o número de proteínas no chip, a reactividade cruzada de um anticorpo pode ser mais estudada em todo o proteasoma humano.
Em resumo, o teste de especificidade de anticorpos é bastante complicado. Os cientistas não enfrentarão a mesma questão quando receberem sinais positivos de seus ensaios baseados em anticorpos.
>A medida que a tecnologia continuar avançando, teremos mais ativos valiosos e procedimentos padronizados para validação de anticorpos.