Asymmetric synthesis of batrachotoxin: Toxinas enantioméricas mostram divergência funcional contra NaV

Os efeitos fenotípicos dos venenos agudos encontrados entre a rica farmacopéia da vida terrestre e marinha têm sido documentados desde a antiguidade. O isolamento e caracterização de compostos tóxicos tem disponibilizado importantes reagentes químicos para o estudo de circuitos bioquímicos complexos (1). Estudos deste tipo revelaram um grande número de peptídeos e agentes de pequenas moléculas que visam os canais de íons de sódio (NaVs), uma classe obrigatória de proteínas de membrana para sinalização bioelétrica (1-4). Entre a coleção de moduladores conhecidos de NaV estão três agentes estruturalmente relacionados, (-)-batrachotoxina , veratridina e aconitina (Fig. 1A) – derivados de aminas lipofílicas de tamanho estético, que se acredita compartilharem um locus de ligação comum na região do poro interno do NaV (3) (local 2, Fig. 1B). A influência dessas toxinas sobre os canais iônicos, entretanto, difere distintamente. Em um extremo, (-)-BTX, o constituinte tóxico primário das rãs-do-dardo venenoso colombianas (gênero Phyllobates), é um agonista de NaV completo, fazendo com que o canal se abra mais rapidamente nos potenciais de membrana hiperpolarizada e bloqueando a inativação rápida (entre outros efeitos característicos) (3-5). Por outro lado, as atividades de veratridina e aconitina são melhor descritas como agonismo parcial e inibição da função do canal, respectivamente (5). Apesar dos recentes insights da biologia estrutural sobre a arquitetura tridimensional dos NaVs procarióticos (6-9), falta uma compreensão molecular da influência das toxinas do local 2 na condução de íons e na cinética dos portais de íons. Estudos de estrutura-actividade das toxinas, em combinação com experiências de mutagénese proteica, podem abordar questões relacionadas com a natureza dinâmica da função do canal e podem orientar o desenho racional de moduladores de pequenas moléculas da actividade dos NaV (1). A potência da (-)-BTX (10), sua história armazenada como a sonda arquetípica do sítio de pequena molécula 2 (4), e seus efeitos inigualáveis sobre a sonda de canais tornam-na um composto “chumbo” ideal para tais investigações.

(-)-BTX ligação a NaVs altera todos os aspectos da função do canal, resultando em uma mudança hiperpolarizada na dependência de tensão de ativação, inibição de inativação rápida e lenta, diminuição da condutividade de um canal e redução da seletividade de íons (3, 4). A utilidade deste produto natural como activador de NaV levou a um esgotamento substancial da oferta mundial, que em tempos ultrapassou 1 g mas era inferior a 170 mg a partir de 2009 (11, 12). Desde que a toxina foi isolada pela primeira vez em 1963 por Märki e Witkop de rãs venenosas coletadas na floresta tropical do norte da Colômbia (13), Phyllobates foi colocado na lista de espécies ameaçadas de extinção, e assim a coleta de (-)-BTX natural desta fonte é restrita. (-)-BTX também foi identificado em espécies selecionadas de aves (gênero Pitohui e Ifrita) (14) e besouros (gênero Choresine) (15), mas apenas em pequenas quantidades (por exemplo, ~1,8 μg de (-)-BTX por besouro). Embora tenham sido divulgadas sínteses semi (16) e racémicas (17) de BTX-A (Fig. 1C), um composto sem o éster de pirrolo C-20, o comprimento de cada um destes trabalhos (>45 passos lineares) impede a produção fácil de (-)-BTX ou análogos selecionados. Assim, nosso desejo de usar BTX e suas formas modificadas para examinar a dinâmica dos canais e os mecanismos de canais de entrada de íons motivou nossos esforços para obter o produto natural através da síntese de novo.

Análise retrospectiva de (-)-BTX levou-nos a delinear um plano que permitiria a montagem em estágio tardio do anel homomorfólico E e a elaboração do éster alélico C-20 (Fig. 1C), facilitando assim o acesso a formas modificadas da toxina. Estudos prévios de relação estrutura-actividade utilizando um pequeno número de derivados semi-sintéticos de BTX (10, 18) e análogos C/D/E-ring BTX (19) revelaram a importância do éster C-20, amina terciária e esqueleto tetracíclico para a actividade agonista do NaV. O desvendamento do BTX-A expõe uma estrutura tipo esteróide 1, cuja montagem é confundida por dois grupos angulares na junção do anel C/D, o exo-etileno C-11 e o alceno C-8/C-9. Para maximizar a convergência em nosso plano sintético, concebemos uma estratégia de desconexão para 1 em todo o anel C. Esta idéia reduziria o problema de construir 1 em dois fragmentos, um expressando o sistema A/B-ring (3, 20) e um segundo compreendendo o ciclopentano D-ring (4, 21). A execução bem sucedida deste esquema poderia produzir a toxina desejada através de uma seqüência de passos lineares totalizando no máximo 20 a 25,

Nossa síntese de (-)-BTX começou com o acoplamento da metileneciclopentanona 4 (21) (fig. S1A) e brometo de vinil 3, acessada de (S)-(+)-Hajos-Parrish ketone através de uma seqüência modificada de passos originalmente delineada por Parsons e colaboradores (20) (fig. S1B). A união dos fragmentos 3 e 4 para gerar o ciclo A/B/D-triciclo 5 ligado apresentou o primeiro de uma série de desafios de desenvolvimento de processos. Uma tentativa inicial de realizar esta transformação envolveu a troca Li-Br de 3 com n-BuLi (Bu, butílica) e a adição sequencial de enone 4. Embora o 5 tenha sido entregue sob estas condições, o rendimento do produto nunca ultrapassou os 30%. Experimentos de têmpera de Deutério com D2O validaram nossa hipótese de que a α-deprotonação de 4 era competitiva com o caminho desejado para a adição de cetona. Reações de transmissão das espécies de vinil-lítio com ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, ethyl), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, trifluorometansulfonato), CeCl3-2LiCl, e LaCl3-2LiCl foram examinadas, mas nenhuma dessas medidas se mostrou eficaz (22, 23). A adição de um equivalente de LiBr anidro ao meio de reação de 3 melhorou a eficiência do acoplamento em >20% (24). Seguindo este chumbo, um protocolo otimizado usando 2,1 equivalentes de t-BuLi, que presumivelmente gera um equivalente de LiBr in situ, reproduziria 5 como um único diatereomer em 65% de rendimento em uma escala multigrama. A facilidade de síntese deste material e a sua forma desiludida 6 possibilitaram esforços subsequentes para identificar condições para a anulação em tandem do anel C e instalação do centro quaternário C-13.

Uma avaliação dos métodos disponíveis para o fechamento do anel de 1,6-eninés levou-nos a considerar processos de iniciação radical (25). Sob tais condições, um radical incipiente C-13 de 3° poderia ser interceptado para forjar a unidade de aminometileno angular (ou um substituto adequado). Os esforços para examinar primeiro a formação do anel C em 6, contudo, revelaram a potencial falácia deste plano. O uso de n-Bu3SnH e triethylborane (Et3B) para promover o evento de ciclização resultou na geração de dois isômeros, 7 e 8, numa relação de 1:5 favorecendo o produto indesejável (Fig. 2A). Estudos realizados por Stork e Beckwith e colaboradores demonstraram que a concentração do substrato e a temperatura da reação podem influenciar o modo de ciclização (ou seja, 5-exo-trig versus 6-endo-trig) em reações enyne mediadas radicalmente (26, 27). Em temperaturas elevadas (130°C) e com diluição quíntupla de 6, observou-se uma inversão na seletividade, o que proporciona um ligeiro excesso do tetráctil desejado (razão 1,3:1 de 7 para 8; Fig. 2A). O rendimento combinado do produto desta transformação excedeu 90%, encorajando assim uma maior exploração desta química, apesar dos modestos resultados da selectividade.

Tentativas repetidas de captura do radical C-13 intermediário com derivados de oxime e hidrazona gerados a partir do formaldeído não conseguiram fornecer o produto de aminometilação esperado (28). Forçados a considerar soluções alternativas, reconhecemos que um grupo de éteres silílicos modificados anexados do álcool C-14 vizinho estaria posicionado apropriadamente para interceptar o radical de 3° (29). Com base nos precedentes disponíveis, um cloreto de alquilo, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, metílico), foi selecionado para modificação do álcool C-14 em 6 (30, Fig. 2A). O tratamento do sililéter resultante (9) com n-Bu3SnH e Et3B a 150°C resultou em uma cascata de ciclagem para dar o pentaciclo 10 como produto exclusivo (31). Dentro dos limites de detecção da ressonância magnética nuclear de prótons (1H NMR), nenhum dos cinco isômeros de anel C correspondentes foi gerado neste processo. Nossos esforços preliminares para entender o papel dos grupos substitutos do C-14 na seletividade de reação sugerem que a proteção silílica do álcool (juntamente com as elevadas temperaturas de reação) favorece o fechamento do anel de 6-endo-trigonometria. Embora estudos adicionais sejam necessários para apreciar esses dados de seletividade de estrutura, nossa cascata de ciclização enyne oferece uma abordagem convergente para sintetizar os andaimes esteróides substituídos e deve facilitar o acesso a uma ampla gama desses compostos.

Inspecção fechada dos produtos de ciclização radical derivados de 6 ou 9 revelou um resultado inesperado relativo à estrutura da parte organoestaniana resultante (Fig. 2, A e B). A carbostanilação do grupo alquilino deve permitir um produto vinil-lanho, conforme observado na reação de 6. Inesperadamente, quando 9 foi submetido às condições de reação, o alquilstannano 10 foi o único produto, resultado confirmado tanto pela RMN quanto pela cristalografia de raios X. A formação do allylstannane 10 pode ser racionalizada através de um mecanismo envolvendo a transferência de 1,4-H-atom de um radical vinil intermediário (32) (Fig. 2B), uma proposta apoiada por um experimento de etiquetagem de deutério (fig. S5). Embora este resultado não tenha sido planejado, a eficiência e seletividade da reação de ciclização compeliu nossa decisão de avançar este material. Olhando para o futuro, a versatilidade do grupo allylstannane deve servir aos esforços futuros para preparar BTXs modificadas por anel C.

A disponibilidade de 10 em nove passos da cetona Hajos-Parrish permitiu a produção de quantidades substanciais de material para completar a síntese alvo. A excisão do éter silílico em 10 foi realizada com excesso de n-Bu4NF, revelando um intermediário de diol que foi posteriormente avançado para 11 através da oxidação do álcool mediada por ácido 2-iodoxibenzóico e clivagem quimiossilano (57%; Fig. 2B). A conversão do aldeído 11 para cloroacetamida 12 foi realizada seguindo uma sequência de três etapas, em frasco único (16, 33). A partir de 12, o fechamento eficiente do anel homomorfolinamida com NaOEt (92%) (17) proporcionou um intermediário versátil para modificação das unidades de anel C e D. Este último poderia ser obtido através do trifato do anel D enol, preparado com KN(SiMe3)2 e PhNTf2.

Introdução do álcool C-11α do anel C allylstannane 13 apresentou um dos desafios mais difíceis na nossa abordagem ao BTX (Fig. 2B). Embora a protodestanilação do 13 para gerar o exo-metileneciclohexano C-11 correspondente tenha tido sucesso limitado (34), todas as tentativas subsequentes de oxidar este composto para cetona 15 (ou seja, O3, OsO4 e RuO4) falharam em dar o produto. Inspirados por um relatório de Kim e Fuchs, nós tentamos converter 13 para o cloreto de alilo correspondente usando CuCl2 (35). Fortuitamente, conduzindo esta reação em dioxano sob condições aeróbias entregamos enal 14 em 85% de rendimento com apenas uma pequena quantidade do produto clorado (~10%). Embora os detalhes mecanicistas desta transformação permaneçam pouco claros, estamos cientes de apenas um outro exemplo documentado de tal reação de oxidação, que utiliza um catalisador de vanádio e O2 (36). Enal 14 está adequadamente disposto para conversão em C-11 cetona 15, seguindo uma série de etapas de interconversão de grupos funcionais destacados por uma reorganização de Curtius (37). A ausência de um cromóforo viável na batrachotoxina A (BTX-A) dificulta a purificação deste material; assim, na sequência que leva ao 15, o metóxido de C-3 acetal foi trocado com p-metoxifenil álcool.

Completamento do esqueleto de carbono de (-)-BTX foi realizado através de um acoplamento cruzado de tributil(1-etoxivinil)estanho a trifla de vinil 15 (Fig. 3A) (38). Hidrólise in situ do éter enolico incipiente com 1 M de ácido oxálico fornecido enone 16 (77%). Após uma extensa tela de agentes redutores, a redução global estereoselectiva bem sucedida do enol 16 foi realizada em 33% de rendimento por tratamento com AlH3 recém-preparado (39). Hipotecamos que o Lewis-basic lactam (ou uma forma reduzida) age como um elemento essencial de estereocontrole, pois o tratamento do enone 15 com agentes redutores de hidretos alternativos forneceu exclusivamente o indesejável álcool C-11β. O uso de AlH3 também favoreceu a geração do epímero alélico C-20 correto, um resultado estereoquímico que pode ser racionalizado através de um modelo que invoca o controle da quelação (38). Deproteção do produto da redução de AlH3 sob condições ácidas proporcionadas pelo (-)-BTX-A em 83% de rendimento (17). Finalmente, empregando uma modificação do protocolo de acilação de Tokuyama, Daly e Witkop’s (-)-BTX-A com a mistura de anidrido preparada a partir de cloroformato de etilo e ácido 2,4-dimetilpirrol-3-carboxílico (10), a síntese de 2 mg de (-)-BTX-A foi completada (79%, 0,25% de rendimento global) em 24 passos de (S)-(+)-Hajos-Parish ketone. O produto foi idêntico em todos os aspectos com uma amostra do material natural e com dados espectroscópicos previamente registados (40, 41). Nosso plano sintético também permitiu a preparação em escala de miligrama do antipode toxina não natural, (+)-BTX, o conhecido éster benzoato de (-)-BTX-A (BTX-B; Fig. 3B) (42, 43), e o enantiômero deste composto (ent-BTX-B).

Caracterização eletrofisiológica do (-)-BTX e BTX-B sintético contra NaV1.4 de rato (rNaV1.4) confirmou que este último também funciona como agonista e é semelhante em potência ao produto natural (fig. S6 e tabela S12). Relatórios anteriores e nossos próprios estudos indicam que o grupo éster do BTX-B é mais estável que o acilpirrol oxidativamente sensível do BTX; assim, experimentos adicionais foram realizados com o primeiro composto (42, 43). O BTX-B sintético foi testado contra um subconjunto de isoformas representativas de NaV, incluindo rNaV1.4, NaV1.5 humano e NaV1.7 humano. A aplicação de 10 μM BTX-B às células do ovário de hamster chinês expressando um único subtipo de NaV resultou em corrente de sódio sustentada em todos os casos (Fig. 4A e figs. S7 e S8). O agonismo dependente do uso de isoformas de NaV pelo BTX-B impediu a inativação em estado estável de >80% da população do canal de sódio (Fig. 4A e fig. S8). BTX-B também induziu um deslocamento hiperpolarizante característico (-44,9 a -51,5 mV) na meia-máxima tensão (V0,5) de ativação de isoformas de NaV do tipo selvagem (Fig. 4B e tabela S13). A semelhança destes dados é consistente com a alta conservação da seqüência proteica entre os subtipos de NaV no revestimento interno dos poros S6 helices que formam o local de ligação da toxina putativa (fig. S9).

Seguindo trabalhos anteriores de nosso laboratório (19) e outros (44, 45), questionamos se a forma enantiomérica do BTX se ligaria com alta afinidade ao NaV com efeitos funcionais análogos. Tal pergunta só pode ser respondida com a disponibilidade de uma síntese de novo da toxina. Assim, os registros eletrofisiológicos com ent-BTX-B foram realizados contra o rNaV1.4. Estes dados revelaram que o ent-BTX-B é um antagonista de canal dependente do uso e do estado, com uma concentração inibitória medida meio-máxima de 5,3 ± 0,6 μM . A concentração para inibição semimáxima do NaV pelo ent-BTX-B é similar em magnitude à concentração semimáxima efetiva para o agonismo BTX-B (1,0 ± 0,1 μM; fig. S10) medida sob condições idênticas. Notavelmente, ao contrário do antípoda natural, a ligação ent-BTX-B causou apenas uma mudança mínima no V0,5 de activação e no V0,5 de inactivação em estado estacionário (tabela S14). Além disso, o bloco de canal foi totalmente reversível por este inibidor.

Para determinar se o BTX-B e o ent-BTX-B compartilham um local de ligação sobreposto dentro da região de poros internos do NaV, o ent-BTX-B foi testado contra cinco mutantes de ponto único rNaV1.4 que mostraram anteriormente desestabilizar a ligação BTX (Fig. 4, E e F, e fig. S12) (19). A mutação de N434 (46), L1280 (47), F1579 (48) e N1584 (48) para lisina resultou em uma diminuição de ~3 a 30 vezes no bloco de corrente por 5 μM ent-BTX-B. Contra F1236K (49), entretanto, o ent-BTX-B reteve atividade significativa (33,6 ± 2,1% de inibição de corrente). A diferença evidente entre o ent-BTX-B e o BTX-B indica uma região de ligação sobreposta, mas não idêntica, dentro da cavidade interna dos poros. Parece que o canal aberto é suficientemente grande para acomodar ligandos de aminas terciárias lipofílicas (19, 45, 50). Alterações subtis na pose de ligação destes ligandos parecem alterar dramaticamente a resposta funcional da proteína. Investigações futuras serão direcionadas para delinear as precisas interações canal-toxina que distinguem ativação da inibição por derivados de BTX e toxinas lipofílicas relacionadas.