Bioatividade Testino-Atividade anti-testecocócica
Os três diferentes chás verdes e seus extratos e partículas obtidos a 5000 rpm e 10000 rpm e 20000 rpm foram estudados por suas propriedades antibacterianas contra o patógeno dentário, S.mutans. A fim de otimizar a concentração do extrato de chá verde para experimentos futuros, seis diferentes concentrações (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL e 500 μL) de GT-0 (sem remover partículas) e 5K-S dos GT 1, GT 2 e GT 3 foram testados contra S. mutans. A Figura 2 mostra os resultados deste estudo. Conforme observado na Fig. 2(a), o método espectrofotométrico revelou que no caso do GT-0 e 5K-S em relação aos três chás verdes, a atividade antiestreptocócica aumentou com o aumento da concentração. 300 μL foram observadas concentrações para mostrar a atividade antimicrobiana ótima e, portanto, distinguida como a concentração otimizada para todos os outros experimentos neste estudo. Assim, a partir de agora, todos os experimentos foram realizados usando 300 μL concentrações das variáveis do chá verde. A Figura 2(b) mostra os resultados obtidos através da avaliação antimicrobiana utilizando o método de contagem total viável. Os resultados da contagem de placas estão correlacionados com os observados no caso das medidas de turbidez baseadas no espectrofotômetro. Outra observação interessante observada a partir destes resultados é a melhora marginal na atividade antimicrobiana observada na remoção das partículas a 5000 rpm (5K-S) em comparação com o GT-0. Comparado ao GT 1-0, o GT 1-5K-S mostrou aumento da atividade antibacteriana, de forma semelhante no caso do GT 2 e GT 3. Além disso, o GT 3 apresentou a maior atividade antibacteriana e o GT 1 a menor atividade antibacteriana.
Optimização do efeito de concentração das variáveis de teste para atividade antimicrobiana usando (a) densidade óptica espectrofotométrica e (b) métodos de contagem total viável.
Desde que a remoção das partículas do chá verde mostrou alterações na bioactividade do extracto de chá verde, foi proposto fazer uma investigação detalhada sobre o estudo deste efeito. Foi realizado um processo sistemático de centrifugação em três etapas, a 5000 rpm, 10.000 rpm e 20.000 rpm, para separar as partículas maiores, menores e ainda menores do extrato. Foram estudadas as partículas grandes (5K-S), partículas pequenas (10K-S) e partículas finas (20K-S) e as partículas (5K-P, 10K-P e 20K-P) para sua interação com S. mutans e suas atividades antibacterianas individuais. A Figura 3 apresenta os resultados deste estudo. Como observado na Fig. 3(a-1,a-2), tanto o método baseado na turbidez quanto o método de contagem de placas, confirmou que, em relação ao GT 1, a remoção do 5K-P resultou em aumento (realce marginal) da atividade antibacteriana do extrato (5K-S) em relação ao GT 1-0. A remoção do 10K-P não resultou em nenhum realce adicional e o 10K-S foi normalmente encontrado como sendo similar à atividade do 5K-S. No entanto, a remoção do 20K-P resultou em uma distinta perda de atividade antimicrobiana no 20K-S. Esta observação foi observada como sendo evidente no caso do GT 2 (Fig. 3(b-1,b-2)) e GT 3 (Fig. 3(c-1,c-2)). Embora a tendência tenha tido diferentes graus de variação do GT 1 ao GT 2 e ao GT 3, o facto de a remoção das grandes partículas de chá verde do extracto ter aumentado marginalmente a propriedade antibacteriana do extracto de chá verde e de a erradicação das fracções menores de partículas de chá verde do extracto levar a uma distinta diminuição da actividade antibacteriana do chá verde permanece inquestionável.
Graph comparando as actividades antibacterianas dos vários componentes do teste (a) GT 1, (b) GT 2 e (c) GT 3 via (a,b,c -1) Método espectrofotométrico e (a,b,c -2) Método de contagem total viável.
No entanto, é importante salientar aqui que nem as partículas 5K-P, 10K-P nem 20K-P apresentaram uma actividade antibacteriana autónoma superior à dos extractos. As partículas de 5K-P mostraram atividade antibacteriana nula, 10K-P mostrou uma extensão limitada de atividade antibacteriana, enquanto os 20K-Ps mostraram alguma atividade em meio às outras duas contrapartidas.
Testes em tempo real de bactéricas dentárias
Para avaliar essa variação na bioatividade dos extratos de chá verde livres das partículas de chá verde em sistemas de tempo real, os extratos foram colocados contra amostras reais de biofilme dentário de cinco voluntários humanos diferentes. Os GT 0, 5K-S e 20K-S dos GT 1, GT 2 e GT 3 foram testados. A figura 4 dá as contagens totais viáveis seguindo o método de contagem de placas, indicando as bactérias que sobreviveram à interação do chá verde. Foi interessante observar que apesar da complexidade da amostra, em comparação com o GT 0, o 5K-S mostrou maior atividade antibacteriana, enquanto o 20K-S mostrou menor atividade antibacteriana em relação aos três chás verdes.
Resultados mostrando o sucesso do efeito antibacteriano dentário demonstrado nas amostras reais obtidas de cinco voluntários humanos.
Fluorescência das células usando acridina laranja, ajuda na visualização e diferenciação entre células vivas/mortas após o tratamento. Imaginamos as amostras de biofilme dentário dos cinco voluntários antes e depois da interação com GT 0, 5K-S e 20K-S e controle. A Figura 5 mostra os resultados da fluorescência mostrando o efeito das variáveis do chá verde no voluntário 1 (A), voluntário 2 (B), voluntário 3 (C), voluntário 4 (D) e voluntário 5 (E). Como observado na Fig 5(a), as imagens de controle em A, B,C,D e E mostram predominantemente fluorescência laranja indicando a presença de bactérias dentárias vivas metabolizadoras. Como observado na imagem, o biofilme deslocado dos dentes manteve sua identidade de biofilme e aparece como tapete microbiano no caso do controle. O tratamento GT 0 resultou no bem esperado efeito mortal esperado do chá verde (Fig. 5(b)) no caso de todos os voluntários. As áreas verdes fluorescentes (células mortas) predominaram, com áreas de fluorescência laranja coexistindo em meio a elas. O painel (c) mostra os resultados do sobrenadante 5K-S do GT 3, onde as maiores partículas de chá verde foram removidas do extrato. Como observado nas imagens microscópicas de fluorescência, não foi observada uma fluorescência alaranjada e uma fluorescência verde completa indicando a aniquilação total das bactérias/biofilme dentário. Também foi interessante observar que não foram mais observadas manchas ou esteiras de biofilme, as esteiras de biofilme foram desintegradas e tudo que é visto são tufos de células dispersas em todas as amostras de teste (A(c), B(c).C(c).C(c).D(c) e E(c). Finalmente, Fig. 5(d) dá os resultados da interação 20K-S, uma queda significativa no efeito de morte do extrato do chá verde é evidente. A ocorrência das células bacterianas vivas fluorescentes da laranja indica uma diminuição na actividade antimicrobiana do extracto ao remover os componentes do nano chá verde. Embora as células mortas verdes fluorescentes também sejam observadas, a proporção para as células vivas/mortas parece alterada. Estes resultados confirmaram a tendência relatada através do método espectrofotométrico e do método de contagem de placas de actividade antimicrobiana dos vários componentes do chá verde de teste.
Epifluorescência micrográfica imaginando a natureza viva/morta do biofilme oral do (A) Voluntário 1 (B) Voluntário 2 (C) Voluntário 3 (D) Voluntário 4 em (a) Controle (sem componente GT) (b) GT 0 (c) 5K-S (d) 20K-S pertencente ao GT 3.
FE-SEM observação do controle e 5K-S bactérias dentais interativas é dada na Fig. 6 (a-c). Conforme observado na figura, o controle (Fig. 6(a)) mostra biofilme bem desenvolvido (Voluntário 4), enquanto o GT 0 (Fig. 6(b)) dos GT 3 e 5K-S (Fig. 6(c)) resultou em danos às células e ao biofilme, conforme indicado pelos resíduos celulares. Imagens capturadas usando CLSM (d) mostram que a grande maioria das bactérias dentárias dos cinco voluntários foram mortas pelo GT 3 (5K-S). Os GT 3-GT 0 e 5K-S foram os mais promissores contra as bactérias dentárias de todos os voluntários.
FE-SEM imagens de amostra dentária de V4 (a) controle (não tratada) (b,c) GT 3 tratada, mostrando danos extensos após incubação com chá verde. (d) mostra as imagens CLSM das células, as células fluorescentes representando as células mortas nos cinco diferentes voluntários após o tratamento com GT 3 20K-P’s.
Caracterização do extracto e das partículas
Com os resultados dos testes de bioactividade baseados na actividade antibacteriana dos componentes do chá verde mostrando que a presença e ausência das partículas de chá verde altera de facto a actividade do extracto, é necessário que os extractos GT 0, 5K-S, 10K-S e 20K-S e depois as partículas 5K-P, 10K-P e 20K-P dos três chás verdes sejam caracterizados de forma elaborada.
Caracterização bioquímica
Atividade antibacteriana é geralmente regida por fenólicos totais, flavonóides e capacidade antioxidante de um extrato. Todos estes parâmetros foram estudados e comparados entre os extratos e as partículas empregadas neste estudo. A Figura 7(a) mostra os resultados obtidos no caso do GT 1, no caso dos flavanóides, como observado no gráfico, não foi observada muita diferença no conteúdo de flavanóides entre os extratos GT 0, 5K-S, 10K-S e 20K-S, o GT 0 pareceu mostrar um aumento marginal em relação aos demais. Entretanto, no caso das partículas de chá verde, o 5K-P registrou o maior conteúdo de flavanóides, com 10K-P e 20K-P seguindo em faixas de flavanóides semelhantes às encontradas nos extratos. No caso do GT 2 Fig. 7(b) e GT 3 Fig. 7(c) o conteúdo de flavanóides foi diferente, os extratos 5K-S e 10K-S apresentaram o maior conteúdo de flavanóides em comparação ao GT 0. As partículas 5K-P e 10K-P apresentaram um conteúdo muito baixo de flavanóides. As exceções foram que os extratos 20K-S apresentaram menores flavonóides comparados aos outros extratos e as partículas 20K-P apresentaram maiores flavonóides em comparação com as outras partículas.
Comparação das atividades bioquímicas do (a) GT 1 (b) GT 2 e (c) GT 3 com base na sua atividade antioxidante (usando DPPH), conteúdo flavonóide (método AlCl3) e fenólicos totais (método de Folin).
Com respeito ao total de fenólicos, no GT 1 o maior foi encontrado no GT 0, enquanto o restante apresentou valores menores. No entanto, no caso do GT 2 e GT 3, observou-se novamente uma tendência semelhante no caso do conteúdo fenólico, onde todos os extractos apresentavam conteúdos fenólicos quase semelhantes. Mas os 5K-P e 10K-P apresentaram menores teores fenólicos em relação aos 20K-P.
Em termos de atividade antioxidante, os extratos GT 1 (GT 0, 5K-S, 10K-S e 20K-S) apresentaram atividade antioxidante muito alta, enquanto que os 5K-P e 10K-P apresentaram atividade antioxidante seis vezes menor. No entanto, é necessário mencionar aqui que os 20K-P mostraram uma actividade antioxidante significativamente mais elevada em comparação com os 5K-P e 10K-P. No GT 2 e GT 3 esta tendência foi mais pronunciada, com os 5K-S e 10K-S exibindo maior atividade antioxidante em comparação ao GT 0. Mas uma diminuição distinta na atividade antioxidante foi observada no caso do 20K-S com um aumento correspondente na atividade no 20K-P do GT 2 e GT 3. É necessário notar que em meio aos três chás verdes estudados, o GT 3 registrou valores mais altos destes compostos bioativos seguidos de perto pelo GT 2 e finalmente ficou significativamente atrás do GT 1. Esta tendência está fortemente correlacionada com a bioatividade antimicrobiana dos chás verdes, que estava na ordem do GT 3 > GT 2 > GT1.
FE-SEM análise
As partículas 5K-P, 10K-P e 20K-P foram imitadas usando FE-SEM para seus detalhes morfológicos e tamanhos. A figura 8 apresenta as morfologias das partículas dos GT 1 (A), GT 2 (B) e GT 3 (C). Morfologias irregulares sem forma distinta foram observadas na maioria dos casos. Como observado na Fig. 8, as partículas do 5K-P no caso dos GT 1 e GT 2 foram macrosizadas, estas são as que vemos visivelmente na nossa chávena de chá verde. A tabela 1 mostra os seus tamanhos, as partículas do GT 2 (B) 5K-P foram as maiores (50-80 μm), seguidas do GT 1(B(a)) que se encontravam na faixa de tamanho 15-25 μm. As partículas do GT 3 5K-P eram relativamente menores na faixa de 6-30 μm (Fig. 8(C(a))). Como observado nos micrográficos, as partículas não eram de tamanhos fixos, que são esperados de tais amostras comerciais não padronizadas. As partículas 10K-P estavam na faixa de tamanho microscópico de 4-10 μm no caso do GT 1 (A(b)), GT 2 foi 2-10 μm (Fig. 8B(b)) e GT 3 na faixa de tamanho de 0,5-3 μm (C(b)). As partículas 20K-P eram menores microsized a nanosized, com partículas GT 1 no regime 0.5-6 μm (A(c)), partículas GT 2 (B(c)) eram 200 nm a 540 nm e partículas GT 3 (C(c)) eram as de menor tamanho existentes no regime de tamanho de 50 nm-300 nm. Assim, como mostram estes resultados, foram observadas partículas 20K-P que possuíam componentes bioativos melhorados e apresentavam propriedades antioxidantes e antibacterianas no regime quase nano.
FE-SEM micrografias de (a) 5K-P, (b) 10K-P e (c) 20K-P de GT 1 (A), GT 2 (B) e GT 3 (C), mostrando a morfologia e tamanho das partículas extraídas. Insets mostram micrografias ópticas das partículas correspondentes.
UV-Vis Spectrophotometry
Figure 9 dá o espectro UV-Vis dos extratos e partículas caracterizadas pelo seu conteúdo de EGCG. Atomssa & Gotlap 201539 relataram a absorvância para a família das catequinas: EGCG mostra uma absorvância na faixa de 248-361 nm em água com λmax a 273,6 nm; ECG 246- 363 nm λmax a 276,8 nm; a faixa espectral do EGC em água é de 254-378 nm e λmax a 269,6 nm e a do EC é de 252-328 nm com λmax a 278,4 nm. Como observado na Fig. 9(a) GT-1, vemos apenas o pico de absorção do EGCG a 273 nm. Em termos de pico de EGCG não foi observada diferença dentro dos extratos (GT 0, 5K-S, 10K-S e 20K-S). No entanto, no caso das partículas de chá verde, observou-se que as partículas de 20K-P apresentaram um aumento significativo na intensidade de EGCG em comparação com as de 5K-P e 10K-P. Foi interessante observar que os 20K-P’s continham quase 50% de EGCG contidos nos extratos.
UV- Espectros visíveis dos vários componentes do chá verde usados como variáveis de teste neste estudo.
No caso do GT 2, observou-se que os extratos mostraram a presença de outros picos da família catequina na faixa de 248-363 nm, como observado a partir dos vários picos de pico nesta faixa na Fig. 9(b). A remoção das partículas do extrato levou a deslocamentos nos picos. Os extratos mostraram especialmente turnos distintos. Entretanto, no caso das partículas 5K-P e 10K-P, observou-se que elas apresentaram apenas picos de EGCG e em baixa intensidade. A ênfase aqui são as partículas de 20K-P que mostraram picos de catequinas de intensidade quase similar aos dos extratos. Foi observado que ao contrário dos 5K-P e 10K-P, os 20K-P não só apresentaram picos de EGCG como também os outros picos da família catequina, bastante semelhantes aos dos extratos.
GT 3 (Fig. 9(c)), os extratos apresentaram vários picos, incluindo os picos da catequina. Entretanto, em comparação com o GT 1 e GT 2, as próprias partículas de 5K-P e 10K-P apresentaram picos de EGCG de alta intensidade. A tendência de que os 5K-P e 10K-P’s mostraram apenas picos de EGCG continuou a ser boa também no GT 3. O 5K-P mostrou EGCG mais alto comparado com seus pares GT-1 e GT 2, mas comparado com os 10K-P do GT 3 ele foi muito mais baixo. O 10K-P do GT 3 mostrou um conteúdo de EGCG semelhante ao dos extratos. Os 20K-P neste caso registraram os picos de catequinas mais altos, superando também os extratos. Foram observados picos de extracção semelhantes aos reportados na extracção de água e de solventes, no caso dos 20K-P’s Vs os extractos. Foi interessante notar que os picos de 20K-P foram mais estreitos e de alta intensidade. Picos excepcionalmente altos a 269 nm correspondentes ao EGC foram observados nos 20K-P’s. Com a observação geral de que os 20K-P’s continham quantidades significativamente grandes de catequinas no GT-1, GT 2 e GT 3 foram confirmados através destes estudos.
FT-IR
O espectro FT-IR obtido das partículas 5K-P, 10K-P e 20K-P do GT 3 que mostraram a máxima atividade antibacteriana e propriedades únicas é apresentado na Fig. 10(a). Os espectros correspondem à banda característica do EGCG. Ponnuraj et al, 201540 relatam impressões digitais de EGCG a 3357,46 cm-1 para o grupo O-H ligado ao anel aromático, 1691,27 cm-1 e 1616,06 cm-1 forte para o grupo C = O que liga o grupo trihidroxibenzoato e grupo cromano, 1447,31 cm-1 para o grupo C-H presente no anel cromano, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 para o grupo O-C = O, 1148,40 cm-1 para o grupo O-H, 1041,37 cm-1 para o grupo C-O-C que liga o anel de Cromano e o anel de trihidroxi benzoato e 825,38 cm-1 para o grupo C-H no anel aromático. Foi interessante e de apoio observar que foi observado um padrão distinto em função do aumento da centrifugação, que corresponde à diminuição do tamanho das partículas. Com 5K-P as bandas EGCG foram de menor intensidade, seguidas por 10K-P e 20K-P apresentaram bandas de alta intensidade. Isto se correlaciona também com os resultados observados nos estudos UV.
FT-IR resultados das partículas 5K-P, 10K-P e 20K-P isoladas do (a) GT 3; (b) 5K-P e 20K-P do GT 1 e (c) as nanopartículas 20K-P isoladas do GT-1, GT 2 e GT 3.
Figure 10(b) mostra os espectros FT-IR obtidos do GT 1 5K-P e 20K-P, No caso do GT 1 não houve muita diferença nas bandas EGCG entre as duas partículas. Estes resultados correspondem aos observados no caso dos estudos espectrofotométricos UV também. A Figura 10(c) apresenta os espectros comparativos dos 20K-P dos GT 1, GT 2 e GT 3. O padrão de gradiente das bandas EGCG aumentadas na ordem do GT 1 < GT 2 < GT 3 é evidente.