II Especificações de Qualidade Microbiológica
Gnotobiótico animais, quer sejam axénicos (i.e, livres de germes) ou associados a um microbioma definido constituído por algumas bactérias não patogénicas, constituem uma pequena fracção dos animais utilizados na investigação; contudo, a sua utilização é susceptível de aumentar com o crescimento da investigação sobre as profundas influências e os diversos efeitos do microbioma na saúde humana e as respostas experimentais dos modelos de investigação (Bech-Nielsen et al., 2012; Friswell et al., 2010; Grada e Weinbrecht, 2013). Como já mencionado, a maioria dos animais de laboratório é referida como SPF para indicar que eles foram mostrados por HM como livres de patógenos em uma lista de exclusão.
Listas de exclusão para roedores, coelhos e outras espécies comuns de animais de laboratório foram substancialmente harmonizadas em todo o mundo desenvolvido devido aos esforços das organizações de ciência animal de laboratório (Guillen, 2012; Nicklas, 2008; Nicklas et al., 2002), e à globalização da pesquisa biomédica. Além disso, a competição por clientes incentiva os fornecedores a oferecer animais com FPS livres de patógenos recém-descobertos e laboratórios de diagnóstico para desenvolver testes para esses patógenos (Shek, 2000). As listas de exclusão para ratos e ratos SPF são mais extensas do que as de coelhos e outras espécies comuns de animais de laboratório por uma série de razões. Primeiro, como os ratos e ratos representam a grande maioria dos animais utilizados na pesquisa, é lógico que se sabe mais sobre os seus patógenos indígenas do que sobre os de outras espécies animais de laboratório menos utilizadas. A diversidade de estirpes de roedores mutantes, naturalmente e geneticamente modificados, altamente susceptíveis a doenças infecciosas (Compton et al.., 2003; Franklin, 2006), em conjunto com métodos de imunoensaio sensível (Smith, 1986b) e avanços na genética molecular (Compton e Riley, 2001), contribuiu para a descoberta e caracterização de patógenos de roedores (Fox et al., 1994; Ward et al., 1994a) que se descobriu ser a causa de infecções onipresentes e inaparentes de colônias de roedores de laboratório (Hsu et al., 2006; Shames et al., 1995). Além disso, a predominância de modelos de pesquisa de roedores murinos tem fornecido fortes incentivos para que laboratórios de diagnóstico e fornecedores desenvolvam e ofereçam ensaios serológicos e PCR específicos para patógenos virais e outros patógenos microbianos fastidiosos – não passíveis de detecção por exame microscópico direto ou isolamento cultural – logo após a sua descoberta. Em contraste, fornecedores comerciais e laboratórios de diagnóstico têm tido pouca demanda das comunidades de pesquisa e medicina animal de laboratório para fornecer testes serológicos e PCR de rotina para vírus de coelhos reconhecidos décadas atrás, como o parvovírus da lapina (Matsunaga e Matsuno, 1983) (que seqüenciou recentemente como um bocavírus (comunicação pessoal, K Henderson)), coronavírus entérico do coelho (Deeb et al, 1993; Descoteaux e Lussier, 1990; Descoteaux et al., 1985), e leporid herpesvirus 2 (Matsunaga e Yamazaki, 1976). Finalmente, a rederivação por histerectomia ou transferência de embriões (ET) para eliminar todos os patógenos exógenos é a prática padrão para ratos e ratos SPF, mas não para outras espécies.
listas de exclusão de SPF para ratos e ratos incluíram todos os vírus exógenos conhecidos, independentemente da virulência, porque como parasitas intracelulares obrigatórios, os vírus são inerentemente invasivos; além disso, mesmo infecções virais não citopáticas mostraram alterar o metabolismo das células hospedeiras (Oldstone et al, 1982). A estrita adesão ao dogma de excluir todos os vírus exógenos de ratos e ratos SPF, no entanto, tornou-se impraticável em muitas instituições de pesquisa onde as infecções assintomáticas por MNV, principalmente em camundongos geneticamente modificados, são consideradas muito difundidas para serem eliminadas. Técnicas de genética molecular de ponta descobriram recentemente um astrovírus murino (Farkas et al., 2012), possivelmente mais comum em ratos do que o MNV, e certamente encontrarão vírus adicionais prevalentes que até agora escaparam à detecção, pois eles, como o MPV, MNV e o astrovírus murino, são altamente adaptados ao hospedeiro e, em grande parte, apatogênicos mesmo para hospedeiros imunodeficientes. Como observado, listas de exclusão viral para coelhos e outras espécies animais de laboratório são menos abrangentes do que para roedores murinos.
Ectoparasitas, helmintos, protozoários patogênicos, bactérias e fungos são parte das listas de exclusão de todas as espécies animais SPF. As bactérias e fungos patogênicos excluídos para animais SPF são principalmente distinguidos de organismos comensal e autóctones (isto é, indígenas) por sua capacidade de cruzar barreiras anatômicas e bioquímicas para se estabelecer em nichos desprovidos de outros microorganismos, como as vias respiratórias inferiores e urogenitais, órgãos internos e intracelulares (Casadevall e Pirofski, 2000; Conselho, 2009; Merrell e Falkow, 2004). A patogenicidade não é necessariamente uma característica imutável das espécies microbianas, já que micróbios normalmente comensal como Escherichia coli foram transformados em patógenos através da aquisição de genes de virulência transferidos de outras bactérias em elementos genéticos móveis como plasmídeos, fagos e transposões (Dobrindt et al., 2004).
Microbios são classificados como patógenos primários se eles podem causar doenças em hospedeiros imunocompetentes. Exemplos incluem Salmonella, Mycoplasma pulmonis, Helicobacter hepaticus, e Clostridium piliforme (a etiologia da doença de Tyzzer). Patógenos oportunistas como Pseudomonas aeruginosa, β- estreptococos hemolíticos, Staphylococcus aureus e fungos Pneumocystis causam doenças principalmente em hospedeiros imunocomprometidos, quer (1) imunossuprimidos por irradiação ou quimioterapia (Bosma et al., 1983; Cryz et al., 1983; Flynn, 1963; Homberger et al, 1993; Rosen e Berk, 1977; Waggie et al., 1988; Walzer et al., 1989; Weir et al., 1986; Weisbroth et al., 1999) ou (2) inerentemente imunodeficientes, como ratos nus atípicos e imunodeficientes combinados graves (SCID) (Bosma et al., 1983; Clifford et al., 1995; Dole et al., 2013b; Henderson et al., 2012; Pantelouris, 1968; Ward et al., 1996). Na sua maioria, apenas patógenos microbianos primários estão incluídos nas listas de exclusão do SPF para animais imunocompetentes. Os oportunistas são adicionados, principalmente por vendedores comerciais, às listas de linhas mutantes imunodeficientes e geneticamente modificadas. Como não é raro que oportunistas como S. aureus causem doenças em linhagens imunocompetentes padrão (isto é, não geneticamente modificadas) de roedores (Besch-Williford e Franklin, 2007), que são frequentemente usadas em esquemas de rederivação e reprodução para linhas geneticamente modificadas, a demanda por linhagens de roedores padrão, imunocompetentes e estoques livres de patógenos oportunistas e primários aumentou. Este subconjunto de animais com SPF tem sido referido como SOPF para patógenos oportunistas específicos livres de patógenos.
Para resumir, os agentes infecciosos nas listas de exclusão de SPF são determinados por critérios gerais e específicos da instituição. Em geral, as listas de exclusão de SPF de camundongos e ratos são mais abrangentes que as de espécies animais menos populares, porque mais patógenos microbianos indígenas assassinos e adaptados ao hospedeiro foram identificados e estudados; ensaios serológicos e PCR são disponibilizados para patógenos assassinos logo após sua descoberta; e a rederivação para eliminar todos os patógenos exógenos exógenos das populações de camundongos e ratos SPF é prática padrão. As listas de exclusão de SPF de todas as espécies normalmente contêm ectoparasitas, endoparasitas e micróbios classificados como patógenos primários, bem como vírus; os fornecedores freqüentemente adicionam patógenos oportunistas para modelos de murinos mutantes imunodeficientes e geneticamente modificados.
O cumprimento dos padrões consensuais de SPF pode ser problemático em uma instituição se a prevalência da infecção for alta ou se os sistemas e práticas de barreira forem inadequados para evitar que infecções adventícias se repitam e se espalhem. Muitas instituições acadêmicas intensivas em pesquisa decidiram que os benefícios de eliminar infecções prevalentes com agentes recentemente reconhecidos como o MNV e Helicobacter, que raramente produzem doenças e/ou têm sido endêmicas para suas colônias de pesquisa por muitos anos, são compensados pela interrupção da pesquisa e pelos custos de fazê-lo. Entretanto, a eliminação (e exclusão) de patógenos prevalentes e o cumprimento das normas consensuais do FPS reduz o risco de que um patógeno infecte colônias adicionais e interfira na pesquisa, e simplifica a troca de modelos animais e estudos colaborativos com outros investigadores e instituições.