Non-organoid Approaches
Até à data, as linhas celulares epiteliais intestinais têm sido os principais sistemas de modelos in vitro para avaliar os processos de transporte intestinal, enquanto as linhas celulares enteroendócrinas são modelos comuns para estudar a secreção de diferentes hormonas intestinais. Um modelo estabelecido para pequenos enterócitos intestinais é a linha celular CaCo-2 (ou o subclone CaCo-2 TC7), derivada de um adenocarcinoma do cólon. Esta linha de células é comumente cultivada em placas transwell até 3 ou 4 semanas pós-confluência para estudos sobre o transporte intestinal de nutrientes, drogas ou outros compostos usando substratos marcados por rádio ou fluorescência (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang e Li, 2017). As células HT-29 (e subclones) são uma linha de células cancerígenas do cólon humano bem estabelecida para a pesquisa de transportadores intestinais, em particular transportadores de açúcar (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). No entanto, para estudar o papel dos transportadores na detecção de nutrientes intestinais, são necessárias outras linhas celulares. As linhas celulares enteroendócrinas mais proeminentes utilizadas para estudos sobre a secreção hormonal intestinal são a linha celular murina GLUTag (Emery et al., 2015), a linha celular murina STC-1 (Jiang et al., 2016), e a linha celular humana NCI-H716 (Pais et al., 2014). Nenhuma delas, entretanto, reflete a complexa biologia das células enteroendocrinas in vivo (Kuhre et al., 2016). As células enteroendócrinas estão distribuídas pelo intestino delgado e grosso, e seus padrões de expressão de diferentes hormônios intestinais diferem muito, dependendo de sua localização dentro do trato intestinal (Habib et al., 2012). Por exemplo, o número de células secretoras de GLP-1 (muitas vezes chamadas de células L) aumenta gradualmente do intestino proximal para o distal, mas as células secretoras de GIP (chamadas de células K) diminuem. Assim, as linhas celulares enteroendócrinas, que são todas derivadas de tumores, representam sistemas modelo muito simples e artificiais para a investigação da detecção de nutrientes, secreção hormonal intestinal, e os mecanismos moleculares e regulatórios subjacentes. A vantagem das linhas celulares de mamíferos é que elas são bem estabelecidas por numerosos laboratórios ao redor do mundo. Há muitos dados científicos disponíveis, assim como protocolos experimentais estabelecidos. Além disso, eles são fáceis de manusear e o cultivo é barato. Ainda assim, todas estas linhas celulares são sistemas de modelos muito simples e artificiais. São na sua maioria derivados de tumores, e representam apenas um único tipo celular, não refletindo a complexidade da mucosa intestinal que compreende vários tipos celulares especializados. Também são geralmente cultivadas em duas dimensões, o que não reflete a arquitetura tridimensional do intestino nativo.
Em particular, para estudos sobre detecção de nutrientes e secreção hormonal intestinal, a cultura primária de células intestinais é uma abordagem muito melhor, e tem sido estabelecida como um modelo confiável nos últimos anos (Reimann et al., 2008). As culturas primárias cultivadas a partir de criptas intestinais isoladas têm a vantagem de poderem ser geradas a partir de diferentes segmentos intestinais (Parker et al., 2012), e de ratos (animais do tipo selvagem ou noctívagos) (Diakogiannaki et al., 2013), ou humanos (Habib et al., 2013). Eles compreendem enterócitos absorventes, assim como diferentes subtipos de células enteroendócrinas, como encontrado no intestino nativo. No entanto, estas culturas contêm enterócitos pouco diferenciados, pelo que não são adequadas para a detecção de transportadores e receptores intestinais a nível proteico ou funcional. Eles são um sistema de cultura a curto prazo, não adequado para experiências a longo prazo, e não podem ser passados, o que aumenta o número de animais de laboratório necessários para a preparação da cultura. O mesmo acontece com as células epiteliais intestinais isoladas (Grossmann et al., 1998), que compreendem todos os tipos de células da mucosa mas apresentam viabilidade muito limitada in vitro, e não representam um epitélio intacto.
Short-term stability is also a limitation of tissue explants, such as everted gut rings (Roder et al., 2014), ou sacos intestinais de rato ou intestino de rato (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016) que são frequentemente utilizados para estudos de transporte. Os anéis intestinais podem ser incubados com substratos rotulados in vitro, ou podem ser preparados após a administração oral de, por exemplo, substratos de transporte rotulados por rádio em roedores (Roder et al., 2014). Os anéis intestinais podem até ser utilizados para estudos de fluxo, uma vez que os compartimentos luminal e basolateral podem ser visados separadamente. No entanto, a preparação e o manuseio não são triviais e requerem alguma experiência. A vantagem dos explantes teciduais é que eles podem ser preparados a partir de diferentes segmentos intestinais, e suas características in vivo, específicas da região, são conservadas in vitro. O explante intestinal conserva sua arquitetura nativa, e a mucosa está conectada ao tecido circundante, como submucosa ou músculo, e neurônios, linfonodos, vasos sanguíneos estão incluídos. Dependendo da questão científica, isto pode ser uma vantagem ou uma desvantagem. A detecção intestinal de nutrientes e subsequente secreção hormonal intestinal é por vezes investigada no intestino roedor perfundido (Kuhre et al., 2015). O animal é anestesiado e a luz intestinal é perfundida com os supostos estimulantes ex vivo. O líquido basolateral é coletado, e o conteúdo hormonal intestinal é analisado. Esta técnica não é tecnicamente fácil, e os obstáculos éticos limitam o amplo uso deste método para estudos sobre a liberação do hormônio intestinal induzido por nutrientes.
Um modelo confiável e bem estabelecido utilizado para estudos sobre características funcionais e regulação dos transportadores intestinais é a expressão heteróloga em oócitos Xenopus laevis (Hirsch et al., 1996). Após a injeção do mRNA, a proteína de interesse é expressa no oócito, e a cinética do transporte pode ser investigada usando substratos marcados por rádio ou abordagens eletrofisiológicas no caso de transportadores eletrogênicos (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Esta técnica é uma excelente ferramenta para estudar as características funcionais de um determinado transportador, embora a proteína alvo esteja em um ambiente artificial e não existam fatores regulatórios, como seriam na célula do mamífero. Além disso, a disponibilidade de oócitos intactos, e o complicado manuseio incluindo a injeção de oócitos, são questões críticas a serem consideradas na aplicação desta técnica. Sistemas de expressão heteróloga muito mais fáceis são a levedura e a E. coli. Eles permitem a geração de mutantes recombinantes que, uma vez gerados, podem ser cultivados ou fermentados em escalas maiores, fornecendo altas quantidades de proteína. Embora baratos e fáceis de manusear, estes microorganismos são sistemas modelo muito simplificados para a investigação de proteínas de mamíferos, e em particular proteínas de grandes membranas. Os problemas que muitas vezes ocorrem são a má inserção da proteína, ou a inserção falhada da membrana. Portanto, estes sistemas são bastante mais úteis para a caracterização estrutural de proteínas purificadas ou domínios proteicos (Beale et al., 2015) do que para estudos detalhados sobre a função e regulação do transportador de mamíferos.
Novel e abordagens promissoras que foram estabelecidas no passado muito recente são modelos tridimensionais de cultura de células de mamíferos. Linhas celulares intestinais como CaCo-2 ou HT-29 são cultivadas em andaimes, criando uma arquitetura mais intestinal que leva a uma melhor diferenciação (Chen et al., 2015). Outros modelos tridimensionais são cultivados diretamente a partir de células epiteliais humanas de pequeno porte e miofibroblastos em membranas microporosas revestidas (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b), e não podem ser multiplicados in vitro. Estes modelos têm o potencial de serem estabelecidos para estudos de transporte de nutrientes ou drogas, e culturas cultivadas a partir de células epiteliais do intestino humano compreendem até diferentes tipos de células da mucosa, mas não células enteroendócrinas. O mesmo acontece com os tecidos de bioimpressão tridimensional, outra tecnologia que surgiu muito recentemente e que tem ganho enorme atenção. Esta abordagem é de maior valor para a medicina regenerativa e transplante do que para a pesquisa experimental (Murphy e Atala, 2014). A bioimpressão de diferentes tecidos, incluindo coração, pele e ossos, foi estabelecida com sucesso, mas os tecidos intestinais bioimpressos são raros até à data e precisam de ser melhorados (Wengerter et al., 2016).